程玉鵬, 李天聰,林進華,李玥玥，寧愿,馬愛萍,李弘琨,王洪月

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150024)

狹葉柴胡愈傷組織原生質體的制備及純化

程玉鵬1,2, 李天聰1,林進華1,李玥玥1，寧愿1,馬愛萍1,李弘琨1,王洪月1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150024)

[目的]以狹葉柴胡愈傷組織為材料，旨在篩選出適合愈傷組織原生質體制備及純化的最優(yōu)條件。[方法]研究了酶的種類及濃度、穩(wěn)滲劑種類、酶解時間及蔗糖分離液濃度等因素對狹葉柴胡愈傷組織原生質體制備和純化的影響。[結果]最佳適宜條件為：2%纖維素酶+1%離析酶，0.6 mol·L-1甘露醇為穩(wěn)滲劑，27 ℃避光預裂解2 h后酶解4 h。在最優(yōu)條件下，原生質體產量可達1.26×106個·g-1。在上述條件不變情況下，用21%蔗糖溶液進行提純，得到的原生質體純化結果較好，純化后原生質體產量可達0.75×106個·g-1。[結論]該研究結果為進一步利用原生質體進行狹葉柴胡基因工程工作奠定了技術基礎。

狹葉柴胡； 愈傷組織； 原生質體制備； 純化

柴胡是我國傳統(tǒng)中藥材，具有疏肝解郁，軀散退熱之功效。我國藥典規(guī)定柴胡或狹葉為正品供藥用，即習稱“北柴胡”與“南柴胡”[1]。近代藥理研究表明，柴胡具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫調節(jié)及抗腫瘤等功效[2，3]，柴胡資源的需求不斷擴大。

植物原生質體是細胞去除堅韌細胞壁后裸露的植物細胞，是對滲透壓極為敏感的球質體[4]。它保持著細胞的生理生化和遺傳學的特性和功能，在植物快速繁殖、遠緣遺傳重組及選育優(yōu)良突變體等方面具有廣闊的應用前景[5]。

植物愈傷組織是薄壁松散的細胞團，其細胞壁易被水解且愈傷組織內有大量細胞間隙，是制備原生質體的理想材料[6]。本試驗利用狹葉柴胡愈傷組織制備原生質體并對其進行純化。從酶液配比、酶解時間及穩(wěn)滲劑種類等方面進行考察[7～9]，建立狹葉柴胡愈傷組織原生質體的制備及純化方法，為今后利用狹葉柴胡原生質體進行遺傳改良、基因工程研究和細胞內信號轉導的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

將狹葉柴胡種子(采自黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物園)培育的無菌苗，切成1 cm的小段接種到含6-BA 3 mg·L-1，2,4-D 0.1 mg·L-1，KT 0.6 mg·L-1的MS固體培養(yǎng)基上，在光照條件下誘導形成愈傷組織[10]。選擇長勢較好的愈傷組織每18 d 繼代培養(yǎng)一次，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同上。

1.2 儀器

電子天平、磁力攪拌器、超純水儀、移液器、自動高壓滅菌器、光照培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、旋渦混勻儀、水浴鍋等。

1.3 試劑的配制

1.3.1 原生質體清洗液(Cell Protoplast Washing, CPW)的配制

按照配方(KH2PO427.2 mg·L-1, KNO3101 mg·L-1, CaCl2·2H2O 1.48 g·L-1, MgSO4·7H2O 246 mg·L-1, KI 0.16 mg·L-1, CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1) 稱取各成分于燒杯中，加入雙蒸水攪拌至充分溶解，定容，過0.22 μm濾膜除菌至錐形瓶內，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂穩(wěn)滲劑及蔗糖分離液的配制

按照所需濃度分別稱取適量甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂和蔗糖，用CPW溶解后，過0.22 μm濾膜除菌至50 mL離心管內，4 ℃保存。

1.3.3 酶液的配制

稱取適量固體酶溶解于0.6 mol·L-1甘露醇穩(wěn)滲劑中，充分溶解后55 ℃水浴加熱10 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，備用。

1.4 原生質體的制備及純化

1.4.1 原生質體分離酶濃度篩選

挑選疏松良好的愈傷組織0.1 g，將其切碎后置于5 mL過濾除菌的混合酶液中，27 ℃黑暗孵育預裂解2 h。酶液濃度分別為1.5%(1%纖維素酶+0.5%離析酶)、3%(2%纖維素酶+1%離析酶)、4.5%(3%纖維素酶+1.5%離析酶)。用移液槍輕輕吹打混勻，再次加入5 mL新鮮配制的酶液。27 ℃避光酶解。

1.4.2 原生質體分離穩(wěn)滲劑的篩選

在由2%纖維素酶 + 1%離析酶組成的混合酶液中，選用0.6 mol·L-1甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂分別作為穩(wěn)滲劑進行滲透壓調節(jié)，測定不同穩(wěn)滲劑下原生質體的分離情況。

1.4.3 原生質體分離酶解時間篩選

在上述條件不變情況下，再次加入酶液后，分別進行2、4、6 h黑暗酶解，測定不同酶解時間下原生質體的分離情況。

1.4.4 原生質體純化蔗糖分離液的篩選

將酶解后的原生質體溶液過200目篩網(wǎng)至離心管中，1 100 r·min-1離心5 min，去上清，將原生質體重懸后，沿管壁慢慢加入蔗糖含量分別為16%、21%、26%、31%的蔗糖分離液上層，1 100 r·min-1離心5 min，此時最下層為細胞碎片，而蔗糖分離液和酶液中間層為原生質體。用0.6 mol·L-1甘露醇穩(wěn)滲劑輕輕洗滌2次。鏡檢計數(shù)。

2 結果與分析

2.1 不同酶濃度組合對原生質體產量的影響

以狹葉柴胡愈傷組織為原料，用不同酶液組合，在酶解時間為4 h，穩(wěn)滲劑為0.6 mol·L-1甘露醇的條件下，進行原生質體的制備。在前期預實驗中，單獨使用纖維素酶或離析酶效果均不佳。本試驗采用纖維素酶和離析酶混酶，實驗表明酶液濃度與原生質體的產量有很大的關系，但并非呈正相關。如圖1所示，結果表明2%纖維素酶 + 1%離析酶組成的混合酶液提取得到的原生質體產量最高，可達1.26×106個·g-1。

圖1 不同酶濃度對原生質體產量的影響Fig.1 Effect of different enzyme concentration on yield of protoplasts

2.2 不同種類穩(wěn)滲劑對原生質體產量的影響

原生質體是僅有質膜包被滲透壓敏感的球質體，在低滲溶液中容易吸水脹裂，在高滲溶液中容易失水皺縮，因此需要選擇適宜的穩(wěn)滲劑以維持滲透壓，從而保證原生質體的生存條件。此外，滲透壓穩(wěn)定劑對酶的活性也有一定的促進作用，是影響原生質體制備的重要因素。在狹葉柴胡愈傷組織原生質體的制備中，選用0.6 mol·L-1甘露醇、氯化鉀及硫酸鎂等作為穩(wěn)滲劑進行篩選，結果如圖2所示，用0.6 mol·L-1甘露醇做穩(wěn)滲劑，原生質體產量相對較高，為1.01×106個·g-1。

圖2 不同種類穩(wěn)滲劑對原生質體產量的影響Fig.2 Effect of different osmotic stabilizer on yield of protoplasts

圖3 酶解時間對原生質體產量的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis on yield of protoplasts

2.3 酶解時間對原生質體產量的影響

在確定最佳酶濃度，穩(wěn)滲劑的條件下，對酶解時間進行了研究。結果如圖3所示，酶解時間為2 h時，原生質體產量較低，可能是由于細酶解時間過短，導致胞壁溶解不充分，原生質體不能充分釋放。當酶解時間延長至4 h時，原生質體的產量達到最佳，約為0.8×106個·g-1，而當延長時間至6 h，原生質體的產量反而有所下降，可能是由于酶解時間過長，損害細胞質膜，對原生質體產生毒害作用，導致其產量下降。

2.4 不同濃度蔗糖分離液對原生質體純化的影響

在上述最佳條件下酶解完成后，分別研究了不同濃度的蔗糖分離液對原生質體純化的影響。如圖4所示，在一定范圍內，隨著蔗糖濃度的增加，純化后的原生質體產量逐漸增加，當蔗糖濃度為26%時，原生質體收獲量最大，若蔗糖濃度超過26%，原生質體產量反而有所下降，可能是與狹葉柴胡愈傷組織原生質體的細胞大小和密度有關。然而，當蔗糖溶液濃度為21%和26%時，所收獲的原生質體產量差距甚微，分別為0.75×106個·g-1和0.81×106個·g-1。對這兩個濃度下的提純結果進行進一步觀察，如圖5所示，21%蔗糖分離液(A)的提純效果要優(yōu)于26%蔗糖分離液(B)，可以看出，蔗糖濃度過高不利于除去原生質體粗提液中的細胞壁碎片或細胞碎片，從而降低原生質體純化的效果。因此，確定濃度21%的蔗糖分離液是最優(yōu)純化條件。

圖4 蔗糖濃度對原生質體純化產量的影響Fig.4 Effect of different sucrose concentration on yield of protoplasts

(A)21% (B)26%圖5 21%和26%蔗糖分離液提純結果圖Fig.5 Purification effects of 21% and 26% sucrose solution

3 結論與討論

本試驗通過優(yōu)化確定原生質體制備及提純的最佳條件為：2%纖維素酶+1%離析酶在27 ℃下黑暗預裂解2 h，再次加入酶液后酶解時間4 h，0.6 mol·L-1甘露醇為穩(wěn)滲劑，21%蔗糖分離液為提純液。在上述條件下，可以制備得到最多的純化原生質體。純化前后原生質體產量分別達1.26×106個·g-1和0.75×106個·g-1。

原生質體制備時，材料本身的性質和生理狀態(tài)對其分離制備有很重要的影響，原生質體的制備和純化對環(huán)境的要求十分嚴格[11]。愈傷組織是一團薄壁的松散的細胞團，其細胞壁易被酶解，是制備原生質體的最佳材料，因此我們選用狹葉柴胡愈傷組織為原材料，進行原生質體的制備。此外，不同酶種類對原生質體分離效果不同，如單獨使用纖維素酶或離析酶雖可制得原生質體，但其效果不佳。其次，不同植物種類原生質體的分離所需要的酶液的濃度也有所差異，這可能是與不同細胞的細胞壁組成成分有關。原生質體是植物細胞去除細胞壁后，僅有質膜包被的球質體，對滲透壓及其敏感，如果酶液中的滲透壓和細胞內的滲透壓不平衡，會造成原生質體脹破或皺縮。因此，選擇合適的穩(wěn)滲劑有著關鍵的作用。酶解時間對原生質體的產量有著一定的影響，不同植物和材料對酶解時間的要求會有所不同。時間太短，酶解不充分，原生質體難以釋放，而時間過長，酶解過度會對原生質體產生毒害作用，導致原生質體皺縮或破裂，造成原生質體產量下降。酶解時間可能與所用材料，酶液的種類和濃度以及酶解溫度有關，要根據(jù)實驗進行相應的情況探索。此外，在原生質體提純過程中，選用21%和26%蔗糖溶液所得到的原生質體產量雖有差異，但差異不顯著，對比鏡檢圖發(fā)現(xiàn)，26%的蔗糖分離液會造成細胞碎片過多，這可能是因為細胞大小和密度等的原因，使其在純化過程中所受離心力有所不適。因此選用21%的蔗糖溶液作為提純液，效果最佳。

原生質體是基因工程的理想受體，是去除細胞壁的敏感球質體，它保持著細胞的生理生化和遺傳特性。利用基因工程技術可對原生質體進行遺傳改良獲得優(yōu)良性狀，如細胞融合，轉基因及紫外誘變等[12]。此外，去除細胞壁的植物細胞在很大程度上能增加信號轉導實驗的可行性，如去除細胞壁之前，細胞壁中存在的非特異性酯酶會影響鈣離子探針Flou-3/AM的裝載，而制備原生質體后則可以使探針順利進入胞內準確檢測Ca2+[13]。狹葉柴胡原生質體的制備為進一步開展狹葉柴胡基因工程工作和檢測細胞內信號轉導途徑奠定技術基礎，同時也對狹葉柴胡次級代謝高產細胞株的選育研究提供了一定的參考。

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(編輯：馬榮博)

Preparation and purification of protoplasts of callus inBupleurumscorzonerifoliumWilld.

Cheng Yupeng1,2, Li Tiancong1,Lin Jinhua1, Li Yueyue1，Ning Yuan1, Ma Aiping1, Li Hongkun1, Wang Hongyue1

(1．CollegeofPharmacy,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040，China; 2．CollegeofLifeScienceandTechnology,HarbinNormalUniversity,Harbin150024，China)

[Objective]Screening the optimal condition on callus protoplast preparation and purification ofBupleurumscorzonerifoliumWilld.[Methods]The effects of some factors on the preparation and purification of protoplasts of callus were investigated, including concentration of enzyme mixture, osmotic stabilizer, incubation time and sucrose concentration.[Results]The optimal condition of protoplast isolation was: 2% Cellulase and 1% Macerozyme, mannitol of 0.6 mol·L-1as osmotic stabilizer, enzymatic hydrolysis 4 h after pre-enzymatic hydrolysis 2 h at 27℃ in dark, the protoplast yield could reach up to 1.26×106per gram of callus. Under this condition, different concentration of sucrose solution was used for protoplast purification. The yield was up to 0.75×106per gram of callus when purified with sucrose at the concentration of 21%.[Conclusion]In conclusion, these results lay a technological foundation of genetic engineering inB.scorzonerifoliumWilld. by using protoplast.

BupleurumscorzonerifoliumWilld.， Callus， Protoplast preparation， Purification

2016-10-13

2016-11-29

程玉鵬(1966-)，男(漢)，黑龍江哈爾濱人，副教授，博士，研究方向：中藥生物技術

國家自然科學基金(81573539)；黑龍江省自然科學基金(H2015042)

Q242

A

1671-8151(2017)04-0254-04