王鍇，孟金柱，李鵬飛，畢錫麟，景炅婕，張子寧，呂麗華*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

牛卵泡可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽候選受體的篩選

王鍇1，孟金柱1，李鵬飛2，畢錫麟1，景炅婕1，張子寧2，呂麗華1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]本研究旨在篩選牛卵泡可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocnine-and amphetamine-regulate transcript, CART)候選受體。[方法]首先對牛卵泡轉(zhuǎn)錄組深度測序所獲得的35 325個表達(dá)基因進(jìn)行篩選，選出ODF1/ODF2(發(fā)情周期第一卵泡波的最大卵泡/第二大卵泡)趨近于無窮大的部分和比值在1.5～2.0之間的部分基因，找出它們的gene symbol，然后利用NCBI和CELLULAR進(jìn)行亞細(xì)胞定位，最后利用跨膜螺旋軟件進(jìn)行α跨膜螺旋區(qū)預(yù)測，從中篩選出含有7個α螺旋跨膜區(qū)的膜蛋白，進(jìn)而篩選出CART的候選受體。[結(jié)果]通過差異表達(dá)基因的篩選、亞細(xì)胞定位和跨膜螺旋區(qū)預(yù)測最終獲得了11個高表達(dá)基因，并根據(jù)篩選出的23個G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)和功能，結(jié)合神經(jīng)肽受體的特征，找出了4個G蛋白偶聯(lián)受體作為CART的候選受體。[結(jié)論]最終將AGTR2、 HTR2B、 S1PR1、 S1PR2作為CART的候選受體，為以后進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

牛卵泡； CART； 候選受體； 跨膜螺旋； 表達(dá)基因； G蛋白偶聯(lián)受體

牛排卵少，繁殖周期長，繁殖率較低，而且繁殖率的高低直接影響著畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。目前，提高牛繁殖率很重要的一種方法是提高它的排卵率。Sen等[1]研究證明，在牛的卵巢上有可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(Cocnine-and amphetamine-regulate transcript, CART) mRNA的表達(dá)，主要是在牛的卵泡顆粒細(xì)胞上有表達(dá)，研究證明CART在一定濃度下對卵泡的發(fā)育有著明顯的負(fù)調(diào)控作用，引起牛卵泡的閉鎖，導(dǎo)致牛繁殖率下降。因此，如果能夠解除這種卵泡閉鎖作用，牛的排卵率就會提高，繁殖率也會相應(yīng)提高。針對此情況，通過對CART做進(jìn)一步的研究，用某種物質(zhì)和CART競爭性地與CART靶位點(CART受體)結(jié)合，即可減少或阻止由于CART與其靶位點結(jié)合而產(chǎn)生的卵泡閉鎖現(xiàn)象，從而提高成熟卵泡的個數(shù)，起到超數(shù)排卵的作用。CART最初是由Kobayashi 等[2]在牛卵巢中發(fā)現(xiàn)的，并經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其對卵泡閉鎖有調(diào)節(jié)作用[3]。Sen等[1]利用G蛋白和蛋白激酶抑制劑對牛卵泡上CART的信號傳導(dǎo)通路做了進(jìn)一步的研究，證明CART對FSH信號通路的多個環(huán)節(jié)、E2分泌和卵泡發(fā)育及閉鎖以及對深刻理解CART潛在的對內(nèi)外生殖系統(tǒng)的作用機(jī)制具有重要意義。Sen、呂麗華等[4]提出了牛卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)CART作用機(jī)制的模型，這一研究成果以對CART信號傳導(dǎo)通路的研究為基礎(chǔ)。呂麗華等[5]通過對比出現(xiàn)偏差后的DF和SF，檢測出SF內(nèi)CART含量高于DF內(nèi)CART含量，之后證明了CART可引起單胎動物的卵泡閉鎖。本研究運用CELLO v2.5和HMMTOP v2.0方法對篩選出的部分基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位和跨膜α螺旋區(qū)預(yù)測，分析跨膜區(qū)找出G蛋白偶聯(lián)受體，進(jìn)而篩選出CART候選受體，為CART功能的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

牛卵泡轉(zhuǎn)錄組ODF1(發(fā)情周期第一卵泡波中最大卵泡)和ODF2(第二大卵泡)深度測序獲得的表達(dá)基因(35 325個)。

1.2 分析方法

1.2.1 篩選差異表達(dá)基因

從35 325個基因中篩選出ODF1/ODF2趨近于無窮大的部分和比值在1.5～2.0之間的部分基因(其他部分的基因已經(jīng)研究過)，然后找出gene symbol。

1.2.2 亞細(xì)胞定位

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和CELLULAR(http://cello.life. nctu.edu.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。使用NCBI時，在NCBI主頁上All Databases下拉框處選擇gene或protein，在右側(cè)搜索框里填上需要搜索基因的名字，空格后輸入bos，得到的就是這個基因在牛這個物種里面的序列，從中選擇一個序列最長的，然后單擊FASTA搜索引擎，會出現(xiàn)整個基因的全序列，將整個基因的全序列復(fù)制。打開CELLULAR(http://cello.life.nctu.edu.tw/)網(wǎng)址的主頁，在ORGANISMS中選擇Eukaryotes，在SEQUENCES中選擇DNA或Protein，然后將該基因的FASTA序列輸入CELLO V2.5對話框，單擊提交，進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.2.3 G蛋白偶聯(lián)受體的預(yù)測

利用跨膜螺旋軟件(http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)進(jìn)行跨膜α螺旋區(qū)預(yù)測，分析跨膜區(qū)，篩選出含有7個α螺旋跨膜區(qū)的膜蛋白。

1.2.4 CART候選受體的篩選

從以上篩選出來的G蛋白偶聯(lián)受體中，根據(jù)其結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行篩選，找出與卵泡閉鎖和細(xì)胞凋亡等有關(guān)的作為CART的候選受體。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

從35 325個基因中篩選出ODF1/ODF2趨近于無窮大的部分和比值在1.5～2.0之間的11個高表達(dá)基因(表1)。

2.2 CART表達(dá)產(chǎn)物亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果

統(tǒng)計結(jié)果顯示：細(xì)胞質(zhì)膜蛋白(Plasma Membrane)占15.79%，細(xì)胞核蛋白(Nuclear)占42.98%，細(xì)胞外蛋白(Extracellaler)占13.14%，高爾基體蛋白(Golgi)占0.25%，細(xì)胞質(zhì)蛋白(Cytoplasmic)占16.46%，線粒體蛋白(Mitochondrial)占9.23%，葉綠體蛋白(Chloroplast)占1.83%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(ER)占0.08%，溶酶體蛋白(Lysosomal)占0.08%，細(xì)胞骨架蛋白(Cytoskeleta)占0.16%，其中細(xì)胞質(zhì)膜蛋白有190個。

2.3 跨膜α螺旋區(qū)預(yù)測結(jié)果

利用http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html軟件進(jìn)行跨膜α螺旋區(qū)預(yù)測，分析跨膜區(qū)，做柱狀圖，如圖1所示，190個細(xì)胞質(zhì)膜蛋白中含有7個α螺旋跨膜區(qū)的細(xì)胞質(zhì)膜蛋白有23個。

表1 ODF1/ODF2趨近于無窮大且比值在1.5～2.0之間的11個高表達(dá)基因

圖1 190個細(xì)胞質(zhì)膜蛋白跨膜α螺旋區(qū)預(yù)測結(jié)果Fig.1 The result of transmembrane α helix prediction of 190 membrane proteins

2.4 G蛋白偶聯(lián)受體篩選結(jié)果

應(yīng)用HMMTOP v2.0對深度測序結(jié)果中篩選出來的膜蛋白進(jìn)行G蛋白偶聯(lián)受體的篩選，結(jié)果篩選出的含有7個α螺旋跨膜區(qū)的膜蛋白有23個，因此這23個膜蛋白就是G蛋白偶聯(lián)受體。如表2所示。

3 討論

目前的研究表明，雖然CART受體的分子特性還不明確，但是可以肯定，CART的生物學(xué)作用是由受體來介導(dǎo)的。Joseph等[6]在研究牛卵泡顆粒細(xì)胞E2產(chǎn)生過程中CART信號通路時，也證明了CART生物學(xué)作用的實現(xiàn)是由受體來介導(dǎo)的，其受體可能是G蛋白偶聯(lián)受體。本試驗通過對以上23種G蛋白偶聯(lián)受體功能的分析，結(jié)合神經(jīng)肽受體的特征(分子量一般為40 000～50 000 Da，組成蛋白的氨基酸序列少于500)，將AGTR2、S1PR2、HTR2B、S1PR1作為CART的候選受體。

AGTR2編碼的蛋白質(zhì)在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中起一定的作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)在維持水、電解質(zhì)平衡、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及調(diào)節(jié)血壓穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用[7]。當(dāng)作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)中最重要介質(zhì)的血管緊張素Ⅱ與其特異性受體結(jié)合時，會對心臟和血管功能、結(jié)構(gòu)和體循環(huán)血流動力學(xué)產(chǎn)生顯著的影響[8]。該膜蛋白已被證明能夠介導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡[9]。該功能可能在發(fā)育生物學(xué)和病理生理學(xué)中發(fā)揮重要作用。

S1PR2(鞘氨醇-1-磷酸酯受體-2)是一種蛋白質(zhì)編碼基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)參與鞘氨醇-1-磷酸誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，存活和轉(zhuǎn)錄的激活，同時可引發(fā)對大多數(shù)類型細(xì)胞和組織的不同生理功能[10]。對細(xì)胞骨架重塑和形態(tài)的變化也有一定的調(diào)節(jié)作用。

HTR2B編碼的蛋白質(zhì)會影響神經(jīng)活動，對胚胎心肌細(xì)胞和心臟的正常發(fā)育和增殖發(fā)揮作用，可防止心肌細(xì)胞凋亡，還可能對肺動脈慢性缺氧具有一定的收縮作用，同時維持正常成骨細(xì)胞的功能和增殖以及正常的骨質(zhì)密度[11]。

表2 篩選出的23個含有7個α螺旋跨膜區(qū)的膜蛋白

S1PR1(鞘氨醇-1-磷酸受體-1)(S1P受體1或S1P 1)，也被稱為內(nèi)皮分化基因1(EDG1)，它屬于鞘氨醇-1-磷酸受體亞家族，該基因編碼的蛋白質(zhì)是細(xì)胞膜鞘磷脂的代謝產(chǎn)物之一，它最初被鑒定為大量存在于內(nèi)皮細(xì)胞，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)中起重要作用，同時與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等有著極為密切的關(guān)系[12]。在多種惡性腫瘤形成、轉(zhuǎn)化和進(jìn)展過程中都發(fā)揮著重要的作用，也可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡以及血管的新生[13]。

對于以上4種CART的候選受體，還需要做進(jìn)一步研究來確定其功能。結(jié)構(gòu)基因功能最終是通過其表達(dá)的蛋白質(zhì)來體現(xiàn)的，因此基因沉默技術(shù)就可以作為一種強(qiáng)有力的研究工具用于功能基因組的研究，它是真核生物細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一種重要手段，隨著基因組學(xué)時代的到來，基因沉默技術(shù)作為有效、經(jīng)濟(jì)的分析基因功能的技術(shù)，已經(jīng)逐漸成為分析所有生物基因功能的有力工具。該技術(shù)結(jié)合蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行配體-受體結(jié)合試驗，可明確上述4種CART候選受體是否為CART受體。這將為進(jìn)一步了解生物體的生理調(diào)控機(jī)制以及疾病的預(yù)防、發(fā)生、治療等多方面提供新的研究方向。

4 結(jié)論

通過對差異表達(dá)基因的篩選、亞細(xì)胞定位和α跨膜螺旋區(qū)預(yù)測最終獲得了23個G蛋白偶聯(lián)受體，對其結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行分析，結(jié)合神經(jīng)肽受體的特征，最終將AGTR2、HTR2B、S1PR1、S1PR2作為CART的候選受體。

[1]Sen A, Bettegowda A, Jimenezkrassel F, et al. Cocaine and amphetamine-regulated transcript(CART) regulation of follicle stimulating hormone signal transduction in bovine granulosa cells [J]. Endocrinology,2007,148(9):4400-4410.

[2]Kobayashi Y, Jimenez-krassel F, Li Q, et al. Evidence that cocaine-and amphetamine-regulated transcript is a novel intraovarian regulator of follicular atresia [J]. Endocrinology,2004,145(11):5373-5383.

[3]Kobayashi Y, Jimenez-Krassel F, Ireland J J, et al. Evidence of a local negative role for cocaine and amphetamine regulated transcript (CART), inhibins and low molecular weight insulin like growth factor binding proteins in regulation of granulose cell estradiol production during follicular waves in cattle [J]. Reprod Biol Endocrinol,2006,4(1):22-33.

[4]Sen A, Lv L, Bello N, et al. Cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CART) accelerates the temination of FSH induced ERK1/2 and AKT activation by regulating the expression and degradation of specific mitogen-activated protein kinase phosphatases in bovine granulosa cells[J]. Mol Endocrinol,2008,22(12):2655-2676.

[5]Lv L, Jimenezkrassel F, Sen A, et al. Evidence for local inhibitory effect of the cocaine-and amphetamine-regulated transcript (CART) peptide on LH-induced thecal androstenedione production [J]. Biol Reprod,2007,77:179.

[6]Folger J K, Jimenezkrassel F, Ireland J J, et al. Regulation of granulosa cell cocaine and amphetamine regulated transcript (CART) binding and effect of CART signaling inhibitor on granulosa cell estradiol production during dominant follicle selection in cattle [J]. Biol Reprod,2013,89(6):137-144.

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(編輯：武英耀)

Bovine follicular conine-and amphetamine-regulate transcript candidate receptors screening

Wang Kai1, Meng Jinzhu1, Li Pengfei2, Bi Xilin1, Jing Jiongjie1, Zhang Zining2, Lv Lihua1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801，China; 2.CollegeofLifeScience,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801，China)

[Objective]This study was performed to screen the candidate receptors of Cocnine-and Amphetamine-Regulate Transcript(CART)of bovine follicles.[Methods]35325 expressed genes obtained from bovine follicular transcriptome after depth of sequencing were screened in this study, selecting out some genes that ODF1/ODF2 tending to infinity and the ratio between 1.5 to 2.0 to identify their gene symbol.Then NCBI and CELLULAR were used to identify subcellular localization, transmembrane helix software was also used in the prediction of transmembrane α helix region, screening out 7 α helix composed of transmembrane region of membrane protein and CART candidate receptor. [Results]Eventually, the 11 highly expressed genes were screened by differential gene expression,subcellular localization and transmembrane helix prediction. According to the structure and function of the screened 23 G protein-coupled receptor and neuropeptide receptor binding characteristics,we find four G-protein-coupled receptors as CART candidate receptors.[Conclusion]The AGTR2、HTR2B、S1PR1 and S1PR2 as CART candidate receptors ultimately,and laid a solid foundation for further study.

Bovine follicle， CART， Candidate receptor， Transmembrane helical， Expressed genes， G protein coupled-receptor

2016-11-05

2016-12-06

王鍇(1992-)，男(漢)，山西壽陽人，碩士研究生，研究方向：動物生殖生理

*通信作者：呂麗華，教授，博士生導(dǎo)師，Tel: 0354-6288863；E-mail：lihualvsxau@126.com

國家自然基金(31172211)；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(2014-重點5)；山西省國際科技合作項目(201603D421006)；山西省三晉學(xué)者和人才引進(jìn)項目；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才博士科研啟動費(2014ZZ04);山西農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新金項目(zdpy201403/201503)

S823

A

1671-8151(2017)04-0263-05