牛云超， 劉丹陽， 張 睿， 尹熙俊， 崔成都,*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院;2.吉林省轉(zhuǎn)基因動物與胚胎工程重點實驗室:吉林 延吉 133002)

促性腺激素受體在母犬生殖器官的表達(dá)定位研究

牛云超1， 劉丹陽1， 張 睿1， 尹熙俊2， 崔成都1,2*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院;2.吉林省轉(zhuǎn)基因動物與胚胎工程重點實驗室:吉林 延吉 133002)

為研究促性腺激素受體(FSHR、LHR)在母犬生殖器官中的分布情況，運用免疫組織化學(xué)SABC法對處于卵泡期、黃體期成年母犬的卵巢、子宮、輸卵管中FSHR和LHR分別進(jìn)行免疫定位。結(jié)果表明：FSHR和LHR陽性細(xì)胞在卵巢主要見于卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、外周生殖上皮細(xì)胞和血管周圍間質(zhì)細(xì)胞；輸卵管中主要分布于輸卵管黏膜表面的柱狀上皮細(xì)胞和肌層細(xì)胞；子宮中主要見于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、子宮腺上皮細(xì)胞。此外，發(fā)情周期不同，F(xiàn)SHR和LHR的表達(dá)量存在差異，卵泡期卵巢FSHR和LHR的表達(dá)量均高于黃體期，且卵泡期卵巢的FSHR陽性反應(yīng)強度均高于LHR；子宮中卵泡期FSHR、LHR的陽性反應(yīng)強度高于黃體期，且黃體期中LHR陽性反應(yīng)強度高于FSHR；輸卵管中卵泡期FSHR、LHR的陽性反應(yīng)強度高于黃體期，且黃體期LHR陽性反應(yīng)強度高于FSHR。本試驗研究促性腺受體在動物生殖器官中的表達(dá)情況，對進(jìn)一步探討動物促性腺激素的作用機制，具有非常重要的意義。

母犬；生殖器官；FSHR；LHR

促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)，是由垂體分泌的促性腺激素(GTH)的主要成分，這些激素必須與靶器官的促卵泡素受體(FSHR)和促黃體素受體(LHR)結(jié)合才能發(fā)揮其生理功能[1-2]。由此可知，研究促性腺受體在動物生殖器官中的表達(dá)情況，對進(jìn)一步探討動物促性腺激素的作用機制，具有非常重要的意義。研究表明，促性腺激素(FSHR、LHR)受體在鼠[3-5]、豬[6]、山羊[7]、水牛[8]等動物[9]的生殖器官中均有表達(dá)，且其表達(dá)量隨發(fā)情周期不同有所差異。

犬是季節(jié)性單次發(fā)情動物，其間情期和乏情期較長，生殖活動和繁殖率具有一定的不穩(wěn)定性等，不同于其他哺乳動物的特殊生殖生理特性。犬的促性腺激素受體定位和表達(dá)還未見報道。因此，本研究采用SABC免疫組化試驗方法，從形態(tài)學(xué)角度入手系統(tǒng)研究母犬在不同發(fā)情周期生殖器官中 FSHR和LHR的表達(dá)定位情況，為探討犬GTH受體調(diào)控犬的生殖生理作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1) 取材 試驗用1～2周歲健康未孕母犬生殖器官(卵巢、輸卵管和子宮)均由吉林龍井市屠宰場提供，屠宰后迅速取出處于卵泡期和黃體期的母犬生殖器官各8組，生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛室溫固定24 h。

2) 主要試劑與儀器 兔抗FSHR/LHR多克隆抗體、FSHR/LHR原位雜交檢測試劑盒、即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒、抗兔SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、多聚賴氨酸、焦磷酸二乙酯(DEPC)等均購自武漢博士德公司；石蠟組織切片機，石蠟包埋機，生物顯微鏡(日本Olympus)，病理圖像分析系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1 切片標(biāo)本制備

固定組織流水沖洗，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，制作5～6 μm厚石蠟組織切片。每個組織選取連續(xù)的相鄰3張切片分別作常規(guī)HE染色、FSHR、LHR免疫組化染色,另取相鄰2張切片分別用于免疫染色對照。

1.2.2 FSHR/LHR免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟入水，3% H2O2室溫孵育，復(fù)合消化液消化 5～10 min，PBS沖洗2 min×3次，滴加 5%BSA封閉液室溫孵育20 min，滴加兔抗FSHR 或 LHR 多克隆抗體(1∶150)，4 ℃孵育過夜，PBS洗5 min×3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG,20 ℃ 20 min，PBS(7.2～7.6)洗5 min×3次，滴加 SABC、20 ℃ 20 min，DAB室溫顯色5～10 min，蘇木素輕度復(fù)染，脫水透明封片，生物顯微鏡觀察照相。 陰性對照以0.02 mol/L PBS代替兔抗FSHR/LHR一抗，其余步驟同上。

1.2.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

FSHR和LHR免疫陽性反應(yīng)物質(zhì)為淺黃色或棕黃色，背景無色或淡藍(lán)色，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色或藍(lán)色，反差明顯。陰性對照呈陰性反應(yīng)。不同發(fā)情周期犬生殖器官中，F(xiàn)SHR和LHR免疫陽性細(xì)胞的染色強度存在差異，由此可知其FSHR和LHR的表達(dá)量不同，染色強度大，相應(yīng)受體的表達(dá)水平越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSHR和LHR在犬卵巢中表達(dá)定位

犬卵巢中，F(xiàn)SHR、LHR免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)主要見于卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、外周生殖上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞。卵泡期，卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、血管周圍間質(zhì)、卵泡膜細(xì)胞等處均呈現(xiàn)中等強度的FSHR陽性反應(yīng)(圖1,A)；卵母細(xì)胞呈現(xiàn)弱強度LHR陽性反應(yīng)，顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞處呈現(xiàn)中等強度LHR陽性反應(yīng)(圖1,B)；黃體期，F(xiàn)SHR陽性反應(yīng)物質(zhì)主要見于生殖上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及淺層原始卵泡中，其中,生殖上皮細(xì)胞呈強FSHR陽性反應(yīng)、間質(zhì)細(xì)胞呈中等強度強度FSHR陽性反應(yīng)、原始卵泡呈弱FSHR陽性反應(yīng)(圖1,D)；生殖上皮細(xì)胞呈強LHR陽性反應(yīng)，間質(zhì)細(xì)胞呈中等強度LHR陽性反應(yīng)，原始卵泡呈弱LHR陽性反應(yīng)(圖1,D)。陰性對照組均呈陰性(圖1,C、F)。

2.2 FSHR和LHR在犬輸卵管中表達(dá)定位

犬輸卵管中，F(xiàn)SHR、LHR免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)主要見于粘膜上皮細(xì)胞、固有層細(xì)胞和肌層細(xì)胞及輸卵管分泌物中。卵泡期，較強的FSHR、LHR陽性反應(yīng)物質(zhì)位于黏膜上皮、肌層和固有層細(xì)胞內(nèi)(圖2,A、B)；黃體期，粘膜固有層和肌層內(nèi)可見弱FSHR、LHR免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)，而粘膜上皮內(nèi)無陽性物質(zhì)(圖2,D、E)。陰性對照組均呈陰性(圖2,C、F)。

A：卵泡期 FSHR陽性；B：卵泡期LHR陽性；C：卵泡期陰性對照；D：黃體期FSHR陽性；E：黃體期LHR陽性 ；F：黃體期陰性對照。箭頭所指為免疫陽性細(xì)胞。

2.3 FSHR和LHR在犬子宮中表達(dá)定位

犬子宮中，F(xiàn)SHR、LHR免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)主要見于宮粘膜上皮細(xì)胞、固有層細(xì)胞、子宮肌層、子宮腺體細(xì)胞及子宮外膜細(xì)胞。卵泡期，F(xiàn)SHR、LHR陽性物質(zhì)在子宮粘膜上皮細(xì)胞、子宮腺細(xì)胞、肌層和外膜等處均有較強染色(圖3,A、B)。黃體期，F(xiàn)SHR陽性細(xì)胞在內(nèi)膜上皮細(xì)胞、固有層細(xì)胞染色較弱，LHR在內(nèi)膜上皮細(xì)胞處有較強染色。其中卵泡期的FSHR、LHR的整體染色強度高于黃體期 (圖3,D、E)。陰性對照組均呈陰性(圖3,C、F)。

A：卵泡期 FSHR陽性；B：卵泡期LHR陽性；C：卵泡期陰性對照；D：黃體期FSHR陽性；E：黃體期LHR陽性 ；F：黃體期陰性對照。箭頭所指為免疫陽性細(xì)胞。

3 討論與結(jié)論

近年來，圍繞GTH受體在動物生殖器官中的作用機制以及定位已有很多研究，在大鼠等嚙齒類動物及豬、山羊、水牛等[3-8]哺乳動物中均作過相關(guān)報道，但對于母犬按發(fā)情周期進(jìn)行GTH受體的研究卻未見報道。

卵巢作為GTH發(fā)揮作用的重要場所，GTH受體主要分布在卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞[9-10]。而本試驗觀察到犬卵巢中FSHR、LHR陽性物質(zhì)，不僅見于卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞，而且在卵母細(xì)胞及血管周圍間質(zhì)也有分布，說明FSHR、LHR的分布特點與促性腺激素的結(jié)合和敏感性應(yīng)具有直接的關(guān)系。

FSHR從只有單層顆粒細(xì)胞的卵泡開始，幾乎出現(xiàn)在所有的卵泡中[11]，這與本試驗結(jié)果一致，表明母犬FSH對腔前卵泡的發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用，但LH對腔前卵泡的發(fā)育作用說法不一，有關(guān)研究報道,LHR在卵泡發(fā)育早期就已存在，隨后也發(fā)現(xiàn)LHR在體外發(fā)育的腔前卵泡中有階段性的表達(dá)[5、12]。本試驗也在母犬原始卵泡及初級卵泡中發(fā)現(xiàn)LHR陽性物質(zhì)，但腔前卵泡中LHR的表達(dá)還有待于進(jìn)一步證實。GTH通過體循環(huán)到達(dá)卵巢內(nèi)的各級血管[2]，本試驗也觀察到卵泡血管周圍間質(zhì)有受體分布，這有利于GTH特異性地識別并穿過血管壁到達(dá)卵泡靶細(xì)胞，使得卵母細(xì)胞保持良好生長趨勢，卵泡才有機會向優(yōu)勢卵泡分化。

Mizarachi D研究表明,促性腺激素在性腺以外的生殖組織尤其是子宮、輸卵管中也有表達(dá)，促性腺激素受體可能直接參與子宮、輸卵管功能的調(diào)節(jié)。在發(fā)情前期及發(fā)情期的牛子宮頸中FSHR的含量高于其他發(fā)情階段[14-15]，而LHR及其mRNA在牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)量卻在黃體期最高[13]。這表明FSH、LH與相應(yīng)的促性腺激素受體處于動態(tài)的平衡過程，F(xiàn)SHR、LHR的分布及功能在卵泡期與黃體期是有區(qū)別的，這與本試驗的研究結(jié)果一致。Derecka K研究表明，在母豬卵泡期和黃體期輸卵管中存在LHR轉(zhuǎn)錄物[16]，這與當(dāng)時所處的發(fā)情周期有關(guān)，在牛的輸卵管粘膜上皮細(xì)胞處也發(fā)現(xiàn)FSHR和 LHR陽性物質(zhì)，進(jìn)一步表明FSH與LH可能直接調(diào)節(jié)輸卵管的功能。

總之，促性腺激素受體在犬不同發(fā)育階段的卵巢、子宮、輸卵管中均表達(dá)，說明母犬生殖器官發(fā)育過程中，GTH與其他哺乳動物一樣，也可能以旁分泌或自分泌的方式在生殖器官發(fā)育、發(fā)情周期中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。但是，本研究僅觀察了卵泡期和黃體期母犬生殖器官中GTH受體表達(dá)情況，發(fā)情期的不同階段雌犬GTH受體表達(dá)有何特點還有待于進(jìn)一步研究。

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Study on the expression and localization of gonadotropin receptors in reproductive organs of bitches

NIU Yunchao1, LIU Danyang1, ZHANG Rui1, YIN Xijun2, CUI Chengdu1,2*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity;2.JilinProvincialKeyLaboratoryofTransgenicAnimalsandEmbryoEngineering,JilinYanji133002)

In this study, we investigated the distribution of gonadotropin receptor (FSHR, LHR) in the reproductive organs of bitches. Immunohistochemical SABC method was used to investigate the expression of FSHR and LHR in the ovaries, uterus and fallopian tubes of foliage for immunization. The results showed that FSHR and LHR positive cells were mainly found in oocytes, granulocytes, follicular cells, peripheral reproductive epithelial cells and perivascular interstitial cells in the ovaries. They were mainly distributed in the columnar epithelium and myometrial cells of the oviducts, and mainly seen in endometrial epithelial cells, uterine glandular epithelial cells of the uterus. In addition, the expression of FSHR and LHR was different, and the expression of FSHR and LHR in ovarian follicle was higher than that of luteal phase. The FSHR positive rate of ovarian follicle was higher than that of LHR. The positive response intensity of LHR was higher than that of luteal phase, and the intensity of LHR was higher than that of FSHR. The positive response intensity of FSHR and LHR in fallopian tube was higher than that of luteal phase. The study of the expression of gonadal receptors in animal genital organs has great significance to further explore the mechanism of action of animal gonadotropin.

Bitch; reproductive organs; FSHR; LHR

2017-02-18 基金項目：吉林省教育廳科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)專項(20150622005005JC)

牛云超(1993—),女，河北石家莊人，在讀碩士，研究方向為獸醫(yī)病理學(xué)與動物生殖生物學(xué)。崔成都為通信作者，E-mail:cdcui@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0071-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.012

S858.292

A