姚利， 聶國輝， 蔡智， 陸興， 劉鳳安

論 著

Hedgehog信號通路中Shh與PCNA蛋白在鼻咽癌中的表達及臨床意義

姚利， 聶國輝， 蔡智， 陸興， 劉鳳安

目的 研究鼻咽癌(carcinomaofnasopharynx，NPC)組織中Shh蛋白的表達以及與增殖細胞核抗原(PCNA)表達的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化Elivision PIus二步法，檢測2009年3月至2014年1月北京大學(xué)深圳醫(yī)院收治的50例鼻咽癌和26例炎性鼻咽部黏膜組織中Shh和PCNA蛋白的表達。結(jié)果 Shh和PCNA在鼻咽癌組織中的陽性表達率均較鼻咽慢性炎癥組織陽性表達率增高(均P<0.05)。鼻咽癌組織中Shh蛋白表達率與鼻咽癌臨床T分期，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；PCNA的表達與鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，但與其臨床分期無關(guān)(P>0.05)。Shh表達與PCNA表達呈正相關(guān)。結(jié)論 Shh蛋白表達與腫瘤的高增殖活性有關(guān)，檢測鼻咽癌組織中Shh及PCNA的表達有利于判斷鼻咽癌原發(fā)病灶浸潤生長程度和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，可為判斷鼻咽癌預(yù)后提供參考。

鼻咽癌； Shh蛋白； PCNA蛋白； 預(yù)后； 腫瘤標記物

近年來，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞和正常細胞生長有相似之處，一些在胚胎發(fā)育、細胞分化過程中起重要調(diào)控作用的Shh信號傳導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用[1]。研究表明，在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Shh通路的異常激活[2-3]。腫瘤細胞過度表達Shh并以旁分泌方式激活鄰近細胞的信號通路，Shh信號通路在間質(zhì)微環(huán)境中的活化可促進腫瘤生長，但在鼻咽癌中其是否存在Shh通道的異常激活，他與癌細胞的增殖活性標志物增殖細胞核抗原(PCNA)是否有關(guān)尚不清楚。本研究擬通過免疫組織化學(xué)方法檢測hedgehog信號通路中Shh蛋白及PCNA在鼻咽癌的表達情況，以探討他們與鼻咽癌組織侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為評估預(yù)后提供新的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年3月至2014年1月北京大學(xué)深圳醫(yī)院鼻咽癌患者的病理石蠟包埋標本50例，為鼻咽癌(carcinoma of nasopharynx，NPC)組。男38例，女12例；年齡20～71歲，平均年齡40歲；均為鼻咽非角化性癌，病理組織經(jīng)HE切片再次復(fù)檢確診；T1期10例，T2期21例，T3期14例，T4期5例；頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無轉(zhuǎn)移20例；患者均未接受過放射治療及化學(xué)藥物治療。對照組為同期活檢的慢性鼻咽黏膜炎性組織標本26例，其中男16例，女10例；年齡19～68歲，平均年齡42歲。

1.2 免疫組化法 兔抗人多克隆抗體Shh購自美國Santa Cruz公司，工作濃度1∶100。鼠抗人PCNA單克隆抗體、PCNA工作濃度為1∶50。Elivision Plus試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。所有的石蠟組織標本連續(xù)切片，每張厚約5 μm。采用免疫組化Elivision Plus二步法，免疫組化染色程序按試劑盒說明書進行。采用已知陽性的肺癌組織作為陽性對照，用PBS代替一抗和二抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 由兩位病理科醫(yī)生采用雙盲法進行判定，Shh陽性表達主要在細胞質(zhì)，呈棕黃色，陽性顆粒粗細不等。PCNA主要表達于細胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒樣分布。顯微鏡下觀察，腫瘤細胞未著色或著色<10%為陰性(-)，腫瘤細胞著色11%～25%為陽性(+)，26%～50%(++)，>51%(+++)，結(jié)果用百分率表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，蛋白表達相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Shh及PCNA蛋白在鼻咽組織中的表達 本組Shh蛋白在慢性炎性鼻咽黏膜組織中僅少數(shù)呈(+)表達，陽性表達率為19.2%；在癌組織中呈(++～+++)表達，其陽性表達率為58.0%。Shh蛋白在伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞胞膜及胞質(zhì)中呈巢狀分布，腫瘤間質(zhì)細胞無染色，在不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞胞膜及胞質(zhì)中呈散在分布，且隨著腫瘤臨床分期的增加，表達亦有增強的趨勢，見圖1～3。

PCNA陽性細胞核呈棕褐色細顆粒狀，范圍與細胞核等大，故核形狀清晰可見，細胞質(zhì)無染色。PCNA在慢性炎性鼻咽黏膜組織中僅少數(shù)呈(+)表達，陽性表達率為34.6%，在癌組織中呈(++～+++)表達，陽性表達率為76.0%。PCNA蛋白在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞核中呈(+++)表達，且癌旁組織多為(+)表達，在不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞核中呈(+～++)表達，見圖4～6。

Shh及PCNA蛋白在NPC和鼻咽炎性患者中的表達情況見表1，Shh蛋白及PCNA在NPC患者中表達均高于慢性鼻咽炎患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 Shh和PCNA的表達在NPC和鼻咽炎性組織中的比較(例)

2.2 NPC中Shh和PCNA的分布與NPC臨床T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 如表2、表3所示，Shh的表達與NPC的臨床T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；PCNA的表達與NPC臨床T分期無關(guān)(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。

表2 Shh和PCNA表達在NPC不同臨床T分期中的比較(例)

表3 Shh和PCNA的表達在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC中的比較(例)

2.3 NPC中Shh及PCNA表達相關(guān)性Spearman等級相關(guān)分析顯示，Shh蛋白與PCNA蛋白表達呈正相關(guān)(P<0.01)，見表4。

表4 NPC中Shh表達與PCNA表達的關(guān)系

3 討論

Nüsslein-Volhard等[4]于二十世紀八十年代首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)了hedgehog(HH)基因，認為在人體胚胎發(fā)育中具有調(diào)節(jié)細胞增殖與分化的作用。而在人類基因組中，HH基因具有3個同源基因：Sonichedgehog(Shh)，Deserthedgehog(Dhh)和Indianhedgehog(Ihh)，分別編碼Shh，Dhh，Ihh蛋白。其中Shh研究最為廣泛，位于7號染色體長臂的3區(qū)6帶(7q36)，編碼一種與早期胚胎發(fā)育密切相關(guān)的Shh分泌蛋白，在人體多種組織細胞中都有分布。新近的研究表明[5]，Shh蛋白參與了基因的轉(zhuǎn)錄，細胞因子以及某些功能蛋白的表達，器官的正常構(gòu)建，腫瘤的發(fā)生等一系列事件。在Shh信號通路激活異常后，可引起許多組織器官腫瘤的形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，炎性鼻咽黏膜組織的Shh多為陰性表達，僅5例呈弱陽性，而NPC組織的Shh表達呈(++～+++)，表達陽性率58.0%，高于炎性組織的19.2%，P<0.05。提示在炎性鼻咽組織中可能也有Shh信號通路的存在，但此通路處于靜止狀態(tài)，而NPC組織中可能存在著此信號通路的過度激活。劉森林等[6]在對68例胃癌組織標本研究中也發(fā)現(xiàn)Shh陽性表達45例，陽性表達率為66.8%，Shh的陽性表達與癌組織浸潤的深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期等密切相關(guān)。這與其他一些學(xué)者[7-9]的研究相似，認為Shh蛋白在干細胞的分裂、分化、死亡等過程中起著重要作用，并影響正常黏膜上皮細胞的分化，使其停止在不同的腫瘤分期。本研究也顯示NPC中Shh表達在T3～T4期高于T1～T2期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(均P<0.05)，提示Shh為NPC上調(diào)的表達蛋白，在NPC的發(fā)展過程中，腫瘤細胞分泌Shh蛋白越多，其浸潤和轉(zhuǎn)移能力越強，其表達升高可能通過激活某種機制而參與了NPC的發(fā)生。另外本研究中Shh蛋白表達位于癌巢腫瘤細胞著色尤為明顯，這也提示具有轉(zhuǎn)移潛能的癌細胞多位于癌巢的周邊，有利于腫瘤細胞脫離原灶向遠處轉(zhuǎn)移。

增殖細胞核抗原PCNA蛋白是一種相對分子質(zhì)量為36KD的酸性蛋白質(zhì)，是DNA聚合酶的輔助蛋白，對調(diào)節(jié)DNA的合成和增殖有重要的作用，僅出現(xiàn)在增殖狀態(tài)細胞核內(nèi)，其表達在G1期開始增強，逐漸增加到S期達到高峰，G2、M期明顯下降，在G0無明顯表達[10]。PCNA表達量的變化與DNA合成一致，可作為細胞增殖狀態(tài)的一項檢測指標[11]。PCNA在腫瘤組織高表達者表明癌組織處于高度增殖狀態(tài)，腫瘤生長速度快，局部浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性大，提示PCNA與腫瘤浸潤深度、TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCNA在NPC組織中的陽性表達率為76.0%，在伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC組織中的陽性表達率高達93.3%，提示PCNA的表達升高有可能參與了NPC細胞的惡性轉(zhuǎn)化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。但本實驗中PCNA表達強度與腫瘤侵襲范圍及分期無關(guān)，這可能與選擇的標本例數(shù)偏少，以及檢測方法不同有關(guān)。推測PCNA是反映NPC增殖活動的重要指標之一，檢測PCNA的表達可以作為預(yù)測鼻咽癌預(yù)后的有用指標，與其他相關(guān)因子聯(lián)合檢測可能更有利于評估鼻咽癌的預(yù)后。

胡偉國等[15]研究認為Shh信號途徑與干細胞的自我更新和增殖密切相關(guān)一致。孫炯等[12]研究中發(fā)現(xiàn)，Shh通過控制細胞周期蛋白D和p21來促進細胞增殖，通過作用于3-磷酸肌醇激酶、Bc1-2而抑制上皮細胞凋亡，促進腫瘤的高增殖活性。本研究發(fā)現(xiàn)，Shh表達與PCNA表達呈正相關(guān)(r=0.426，P<0.05)，提示Shh蛋白表達可能與腫瘤細胞的增殖相關(guān)。結(jié)合相關(guān)研究，初步推測，在組織細胞的損傷修復(fù)過程中，Shh信號通路呈一過性激活，促進上皮細胞中的干細胞自我更新，但長期慢性刺激使Shh信號持續(xù)活化，使腫瘤細胞的PCNA陽性表達率顯著增高，誘導(dǎo)誘導(dǎo)細胞的無序增殖而誘發(fā)惡變。

綜上所述，檢測NPC組織中的Shh及PCNA表達有利于判斷NPC原發(fā)病灶浸潤生長程度和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，能為評估NPC的預(yù)后提供參考。

[1] Barakat MT, Humke EW, Scott MP.Learning from Jekyll to control Hyde: Hedgehog signaling in development and cancer [J]. Trends Mol Med, 2010, 16(8):337-348.

[2] Kawabata A, Kawao N. Physiology and pathophysiology of proteinase-activated receptors (PARs): PARs in the respiratory system: cellular signaling and physiological/pathological roles [J]. J Pharmacol Sci, 2005, 97(1):20-24.

[3] 陳筠，張雙衛(wèi),王銀全.苦參堿對人膽管癌細胞QBC939增殖和凋亡的影響[J].中華實驗外科雜志,2005,22(5):627.

[4] Nüsslein-volhard C, Wieschaus E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila[J]. Nature，1980, 287(5785):795-801.

[5] Pak E, Segal RA. Hedgehog Signal Transduction: Key Players, Oncogenic Drivers, and Cancer Therapy[J].Dev cell, 2016, 38(4):333-344.

[6] 劉森林,譚衛(wèi)澤,龍劍斌.SHH在胃癌組織中的表達及臨床意義[J].中外醫(yī)療,2012,15(13): 7-9.

[7] Lee SY, Han HS, Lee KY, et al. Sonic hedgehog expression in gastric cancer and gastric adenoma[J]. Oncol Rep, 2007,17(5):1051-1055.

[ 8] Douard R, Moutereau S, Pernet P, et al. Sonic Hedgehog-dependent proliferation in a series of patients with colorectal cancer[J]. Surgery, 2006, 139(5):665-670.

[9] 馮亞光,魏正強. Shh、Gli1、Foxm1蛋白在胃癌中的表達及臨床意義[J]. 廣東醫(yī)學(xué),2011,32(19): 2536-2538.

[10] Aaltomaa S, Lipponen P, Syrjanen K. Prognostic value of cell proliferation in breast cancer as determined by proliferating cell nuclear antigen(PCNA) immunostaining[J]. Anticancer Res, 1992,12(4):1281-1286.

[11] 李蘭,張維元.P27kipl、P16蛋白和增殖細胞核抗原在鼻咽癌中的表達及其意義[J].中華病理學(xué)雜志,2003,32(4):347-349.

[12] 孫炯,楊留才,李仕紅，等.p21與PCNA在子宮內(nèi)膜癌中表達水平及相關(guān)性研究[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,26(11):1111-1113.

[13] 劉益平.腸癌中EGFR、PCNA及COX-2的表達及意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志,2015,17(8): 68-70.

[14] 邱連升, 王佳蓉, 陳翊民, 等. 喉鱗癌和癌前病變中細胞凋亡及 PCNA、P53、Bcl-2表達研究[J]. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘, 2015, 15(36): 8-9.

[15] 胡偉國,王春友,劉濤,等. SHH、EGFR和PCNA蛋白在胰腺癌組織中的表達及其意義[J].癌癥, 2007, 26(9): 947-951.

Expression of Shh protein and PCNA protein in hedgehog signal transduction pathway in nasopharyngeal carcinoma

YAOLi,NIEGuohui,CAIZhi,LUXing,LIUFeng’an.

(DepartmentofOtolaryngology,PekingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036，China)

Correspondenceauthor:LUXing,Email:Luxing006@126.com

Objective To study the expression of Shh protein and proliferating cell nuclearantigen(PCNA) in nasopharyngeal carcinoma. Methods Immunohistochemical Elivision PIus two-step method, to detect the expression of Shh and PCNA protein in 50 cases of nasopharyngeal carcinoma and 26 cases of inflammatory nasopharyngeal mucosa during March 2009 to January 2014,at the Peking University Shenzhen hospital. Results Shh and PCNA in nasopharyngeal carcinoma (NPC) were compared with nasopharyngeal tissue of chronic inflammation showed higher expression(P<0.05).In the NPC tissues between Shh expression and the degree of cervical lymph node metastasis is significantly correlated (P<0.05)；Shh protein expression and NPC clinical staging has close relationship(P<0.05). The expression of PCNA in NPC and cervical lymph node metastasis is correlated ,but not correlated with the clinical stage. Shh high expression of the case group PCNA positive rate is also high； and Shh low expression of the case group PCNA positive rate is low, the two expression is positively correlated. Conclusions Theexpression of Shh protein was related to the high proliferative activity of the tumour, Shh and PCNA detection in nasopharyngeal carcinoma (NPC), help to judge nasopharyngeal carcinoma primary lesion growth degree of infiltration, and the transfer of risk, provide a reference for judging the prognosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC).

Nasopharyngeal carcinoma； Shh； PCNA； Prognosis； Tumor marker

廣東省深圳市科技計劃項目(201302072)

518036 廣東 深圳， 北京大學(xué)深圳醫(yī)院 耳鼻咽喉科

陸興，Email：Luxing006@126.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.01.005

1674-4136(2017)01-0017-04

2016-05-01][本文編輯：李慶]