許菊青， 楊舒， 毛啟星， 樊衛(wèi)飛， 蔣峰

論 著

CYP3A4、CYP3A5在肺腺癌中表達及其與預后的相關性

許菊青， 楊舒， 毛啟星， 樊衛(wèi)飛， 蔣峰

目的 探討CYP3A4、CYP3A5在肺腺癌組織中的表達水平及與預后的相關性。方法 收集南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸外科87例肺腺癌病理組織及其對應的臨床資料，病理標本制作組織芯片，通過免疫組化法明確組織芯片中CYP3A4、CYP3A5蛋白的表達情況，結合臨床病理特征和隨訪資料進行統計分析。結果 肺腺癌組織芯片的免疫組化結果顯示，CYP3A4在肺腺癌組織中顯著高表達，而其在癌旁正常組織中則顯著低表達(P=0.012)；肺腺癌中CYP3A4的表達水平與肺腺癌TMN分期(P=0.013)和腫瘤分化程度(P=0.044)相關。與之相反，CYP3A5在肺腺癌組織中的表達水平顯著低于癌旁正常組織(P<0.001)；肺腺癌中CYP3A5的表達與肺腺癌組織分化程度(P=0.013)顯著相關。CYP3A4高表達患者總生存期和無瘤生存期較CYP3A4低表達患者顯著縮短(P<0.05)，CYP3A5低表達患者總體生存期和無瘤生存期較CYP3A5高表達患者顯著縮短(P<0.05)；聯合分析顯示，CYP3A4高表達合并CYP3A5低表達的患者預后較其他患者差(P<0.05)，COX多因素分析顯示，CYP3A4高表達合并CYP3A5低表達為肺腺癌預后不良的獨立危險因素。結論 CYP3A4高表達合并CYP3A5低表達是影響肺腺癌患者預后的獨立危險因素；CYP3A4高表達合并CYP3A5低表達可作為預測肺腺癌預后的一個新靶標。

CYP3A4； CYP3A5； 肺腺癌； 預后； 免疫組化

CYP3A4和CYP3A5是細胞色素P450酶系(cytochrome P450 enzyme system，CYPs)3A亞家族的主要成員。其傳統的生物學功能是參與內外源性物質代謝。目前的研究熱點主要集中在CYP3A4、CYP3A5多態(tài)性和腫瘤易感性，以及化療藥物代謝和腫瘤患者預后的關系方面。我們采用免疫組化法檢測肺腺癌組織芯片CYP3A4和CYP3A5的表達，分析并探討CYP3A4和CYP3A5與肺腺癌臨床病理參數及預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 87例肺腺癌組織切片標本及相應癌旁組織切片標本都來自南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，臨床數據(包括患者性別、年齡、吸煙情況以及腫瘤分期、大小、分化程度、淋巴結轉移)來源于該院病案室的病案記錄。按照TNM分期標準：Ⅰ期34例，Ⅱ期24例，Ⅲ期29例。其中男性21例，女性66例。年齡30～78歲，平均年齡65.21歲。87例均具有隨訪記錄，隨訪率100%?；颊邿o瘤生存期(Disease-free survival, DFS)是從手術當天至疾病復發(fā)的時間，總生存期(Overall survival，OS)即手術當天至隨訪日(通過身份證信息或電話隨訪)。

1.2 組織芯片制作及免疫組化染色 87例肺腺癌組織標本均為10%甲醛固定，石蠟包埋，蠟塊經篩選無明顯缺陷。制作成組織芯片。免疫組織化學染色按En Vision二步法進行，具體步驟按說明書進行。CYP3A4單克隆抗體經Tris-EDTA緩沖液(pH=9.0) 沸水浴抗原修復，DAB顯色，以試劑盒提供的陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照，在顯微鏡下結合常規(guī)HE染色片觀察切片的顯色反應。重復以上操作檢測CYP3A5。

1.3 結果判定 分別觀察CYP3A4、CYP3A5蛋白的分布、陽性強度和陽性率。免疫組化結果判斷采用雙盲法，由兩位病理科醫(yī)師對組織芯片上每個位點的染色結果進行評價。在高倍鏡下(×400)分別對每個位點計數100個細胞，每例共計400個，按要求分別記錄染色陽性細胞百分比及強度。若遇到各代表位點染色差異較大的情況，則另作該例標本的常規(guī)切片觀察。免疫組化染色陽性信號為棕黃色或褐色，在高倍鏡下觀察，根據染色陽性腫瘤細胞數目所占百分比計分：陽性細胞數占0%為0分；1%～33%為1分；34%～66%為2分；67%～100%為3分。染色強度按腫瘤細胞著色的深淺計分：無著色為0分，黃色為弱陽性計1分，淺棕色為中等陽性計2分，棕褐色為強陽性計3分；根據染色強度和陽性細胞數計分之和進行判斷：0～2分為低表達，3～6分為高表達。

1.4 實驗數據處理及統計分析 應用SPSS 17.0軟件分析。計量資料采用四格表χ2檢驗、Fisher確切概率法，生存分析用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗以及COX回歸分析,以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CYP3A4、CYP3A5在肺腺癌中的表達 87例肺腺癌組織切片標本行免疫組化染色后顯示，CYP3A4、CYP3A5主要表達于細胞質，少數可同時表達于細胞核。CYP3A4在肺腺癌組織中顯著高表達，其表達陽性率為73.6%(64/87)，而在癌旁正常組織中則顯著低表達(P=0.012)；CYP3A5在肺腺癌組織中的表達顯著低于癌旁正常組織(P<0.001)，CYP3A5在肺腺癌組織中呈弱陽性表達，其表達陽性率為49.4%(43/87)(圖1～2)。

2.2 CYP3A4、CYP3A5的表達與臨床病理參數及預后的關系 CYP3A4在肺腺癌中的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結轉移、胸膜侵犯無關，而與TMN分期(P=0.013)和分化程度(P=0.044)相關。CYP3A5在肺腺癌中的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結轉移、TMN分期和胸膜侵犯無關，而與分化程度(P=0.013)顯著相關(表1)。

圖1 肺腺癌組織及癌旁正常組織CYP3A4表達(×400)

圖2 肺腺癌組織及癌旁正常組織CYP3A5表達(×400)

表1 CYP3A4、CYP3A5表達與肺腺癌臨床病理特征的關系

*：不同表達水平比較，P<0.05

2.3 預后分析Kaplan-Meier生存分析顯示，CYP3A4高表達患者總體生存期(P=0.002)和無瘤生存期(P=0.002)較CYP3A4低表達患者顯著縮短， CYP3A5低表達患者總體生存期(P=0.006)和無瘤生存期(P=0.007)較CYP3A5高表達患者顯著縮短。聯合分析顯示，CYP3A4低表達合并CYP3A5高表達與CYP3A4低表達合并CYP3A5低表達患者預后較好，這兩組患者間的生存期沒有明顯差異；CYP3A4高表達合并CYP3A5低表達與CYP3A4高表達合并CYP3A5高表達總體生存期和無瘤生存期明顯縮短，其中CYP3A4高表達合并CYP3A5低表達的患者總生存期(P=0.036)和無瘤生存期(P=0.036)最短，預后最差。再進一步分析發(fā)現，CYP3A4高表達合并CYP3A5低表達是影響肺腺癌患者預后的獨立危險因素。

3 討論

CYP3A4和CYP3A5是細胞色素酶P450 CYP3A亞家族的2個主要成員，其含量豐富，底物覆蓋廣泛，兩者催化50%以上臨床常用藥物的氧化還原反應[1]，包括抗雌激素藥物他莫昔芬，抗癌藥物環(huán)磷酰胺、多西他賽、長春堿類，以及靶向藥物索拉菲尼、舒尼替尼等，是藥物代謝反應中最主要的限速酶。CYP3A還參與了多種前致癌物質和致突變物的活化代謝過程，并與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關。

CYP3A4主要分布在肝臟和小腸，是成人肝臟表達的主要CYP蛋白，CYP3A5主要分布于一些肝外組織如腸壁、腎、前列腺和肺等。CYP3A4和CYP3A5的表達及活性有著很大的個體間、種族間差異，這主要由CYP3A單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)決定。

CYP3A4/CYP3A5在肺癌中的作用尚不明確，研究結果也不盡相同。一組涵蓋了801例患者的病例對照研究顯示攜帶CYP3A4*1B基因型可明顯增加小細胞肺癌的發(fā)生風險[2]。另有研究發(fā)現CYP3A5*3純合子基因型使肺癌的發(fā)生風險增加了4.3倍，并且CYP3A4*1B和CYP3A5*3多態(tài)性決定了在化療藥物療效及毒性方面存在個體差異性，兩者在指導肺癌個體化治療及藥物代謝方面起重要作用[3]。但是，通過檢索pubmed數據庫，截至2016年9月，未見有CYP3A4、CYP3A5對肺癌惡性生物學行為及預后的影響方面的報道。

本研究結果顯示，CYP3A4在肺腺癌中顯著高表達，且腫瘤分期越晚、分化程度越低其表達越高。CYP3A4低表達組患者總體生存期和無瘤生存期較CYP3A4高表達組患者明顯延長，提示CYP3A4高表達可能在促進肺腺癌侵襲轉移方面發(fā)揮重要作用，從而導致較差的預后。Mitra等[4]通過體外實驗發(fā)現CYP3A4促進激素受體陽性乳腺癌細胞惡性增殖的信號通路，CYP3A4促進(±)-14，15-EET(環(huán)氧二十碳三烯酸)生物合成，抑制了激活因子3(STAT-3)磷酸化作用和核轉運，從而導致惡性細胞的無限增殖。另一項研究發(fā)現，CYP3A4具有促進肝癌細胞增殖的“癌基因”生物學功能，機制可能是CYP3A4可通過造成肝癌細胞低氧環(huán)境來誘導低氧反應元件(HRE)啟動子活性的增強，促進促紅細胞生成素(EPO)和血管內皮生長因子(VEGF)mRNA表達含量的增加，繼而誘導磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的活化，PI3K/Akt參與調節(jié)腫瘤細胞的增殖遷移[5]。

本研究結果還顯示CYP3A5在癌旁正常肺組織的表達明顯高于腫瘤組織，這與Anttila等[6]的研究結果一致。癌組織中CYP3A5高表達組患者總體生存期和無瘤生存期較低表達組患者明顯延長，提示CYP3A5可能在腫瘤侵襲轉移過程涉及細胞-細胞間及細胞-基質間的相互作用中發(fā)揮抑癌作用。研究表明，CYP3A5活性酶能催化6β-羥基睪酮，誘導睪酮失活，從而抑制激素依賴性的前列腺細胞的惡性增殖[7]。Jiang Feng團隊[8]發(fā)現CYP3A5可作為一個保護性因子抑制肝細胞肝癌的侵襲轉移，其抑制肝癌細胞侵襲轉移的分子機制是CYP3A5通過細胞內ROS單純抑制mTORC2激酶活性，進而選擇性抑制AKT(S473)活化，引起AKT信號通路下調，從而抑制肝細胞肝癌侵襲轉移。

進一步分析，我們發(fā)現高表達CYP3A4合并低表達CYP3A5的肺腺癌患者預后最差，是影響患者預后的獨立因素。因此認為，高表達CYP3A4和低表達CYP3A5可能可以作為預測肺癌預后的新靶標，為肺癌的個體化治療提供理論依據。

[1] Wojnowski L. Genetics of the variable expression of CYP3A in humans[J]. Ther Drug Monit, 2004, 26(2):192-199.

[2] Dally H, Edler L, J’ger B, et al. The CYP3A4*1B allele increases risk for small cell lung cancer: effect of gender and smoking dose[J]. Pharmacogenetics, 2003, 13(10):607-618.

[3] Subhani S, Jamil K, Atilli S. Association of CYP3A4*1B and CYP3A5*3 genetic polymorphisms with lung cancer and its impact on taxane metabolism in indian population[J]. Acta Medica International, 2015, 2(2):19-27.

[4] Mitra R, Guo Z, Milani M, et al. CYP3A4 mediates growth of estrogen receptor-positive breast cancer cells in part by inducing nuclear translocation of phospho-Stat3 through biosynthesis of (±)-14,15-epoxyeicosatrienoic acid (EET)[J]. J Biol Chem, 2011, 286(20):17543-17559.

[5] Oguro A, Sakamoto K, Funae Y, et al. Overexpression of CYP3A4, but not of CYP2D6, promotes hypoxic response and cell growth of hep3B cells[J].Drug Metab Pharmacok, 2011, 26(4):407-415.

[6] Anttila S, Hukkanen J, Hakkola J, et al. Expression and localization of CYP3A4 and CYP3A5 in human lung[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997, 16(3):242-249.

[7] Bangsi D, Zhou J, Sun Y, et al. Impact of a genetic variant in CYP3A4 on risk and clinical presentation of prostate cancer among white and African-American men[J].Urol Oncol, 2006, 24(1):21-27.

[8] Jiang F, Chen L, Yang YC, et al. CYP3A5 Functions as a Tumor Suppressor in Hepatocellular Carcinoma by Regulating mTORC2/Akt Signaling[J]. Cancer Research, 2015, 75(7):1470-1481.

Relationship between the expressions of CYP3A4, CYP3A5 and prognosis in lung adenocarcinoma

XUJuqing1,2,YANGShu2,MAOQixing1，FANWeifei2,JIANGFeng3.

(1.TheFourthSchoolofClinicalMedicine,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China; 2.DepartmentofOncology,JiangsuProvinceGeriatricHospital,Nanjing210024,China; 3.DepartmentofThoracicSurgery,NanjingMedicalUniversityaffiliatedCancerHospital,Nanjing210009,China)

Correspondingauthor：JIANGFeng,Email：jiangfeng174@sohu.com

Objective To investigate the expression of CYP3A4 and CYP3A5 in lung adenocarcinoma and its correlation with prognosis. Methods The clinical features of 87 lung adenocarcinoma patients were collected. Subsequently, immunohistochemical (IHC) analysis was performed to detect CYP3A4 and CYP3A5 expressions in 87 lung adenocarcinoma cases on a tissue microarray sample. Finally, the relationship between CYP3A4 and CYP3A5 expression as well as the clinic pathological characteristics of NSCLC were analyzed statistically. Results Our study showed that the expression of CYP3A4 was significantly higher in lung adenocarcinoma than that in normal tumor-adjacent tissues (P=0.012). CYP3A4 protein expression in lung adenocarcinoma was related to TNM stage (P=0.013) and differentiation (P=0.044). Expression of CYP3A5 was lower in lung adenocarcinoma than that in normal-adjacent tissues (P<0.05). Significance was observed between CYP3A5 expression and differentiation (P=0.013). The Kaplan-Meier method suggested that high CYP3A4 and low CYP3A5 expressions were significantly associated with short disease-free survival and overall survival of patients. Conclusions This study provides evidence that the high CYP3A4 and low CYP3A5 expression level was an independent risk factor of lung adenocarcinoma and could act as a new target for prognosis of lung adenocarcinoma.

CYP3A4; CYP3A5; Lung adenocarcinoma; Prognosis; Immunohistochemical

210029 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學第四臨床醫(yī)學院(許菊青，毛啟星)； 210024 江蘇 南京，江蘇省老年醫(yī)院腫瘤科(許菊青，楊舒，樊衛(wèi)飛)； 210009 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 胸外科(蔣峰)

蔣峰，Email：jiangfeng174@sohu.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.01.006

1674-4136(2017)01-0021-04

2016-10-27][本文編輯：李筱蕾]