張 宇，張 玥，馬 寧，王志成

（黑龍江省科學(xué)院 能源環(huán)境研究院，黑龍江 哈爾濱 150090）

UPLC法檢測HNHHJ-1菌株發(fā)酵液中2-羥基聯(lián)苯含量*

張 宇，張 玥，馬 寧，王志成**

（黑龍江省科學(xué)院 能源環(huán)境研究院，黑龍江 哈爾濱 150090）

采用超高效液相色譜法(UPLC)測定脫硫菌發(fā)酵液中2-羥基聯(lián)苯（2-HBP）的含量。色譜柱為ACQVITYDPLC@BEH C18（2.1×50mm,1.7μm,Waters），流動相為甲醇∶水（90∶10，V/V），柱溫30℃，流速0.2mL/min，進(jìn)樣量2μL，PDA檢測器檢測2-HBP，檢測器檢出限范圍為0～200mg/L。結(jié)果顯示2-HBP的保留時(shí)間為0.74min。利用該檢測方法得到HNHHJ-1菌株培養(yǎng)后的發(fā)酵液中2-HBP的含量為5.35mg/L。

超高效液相色譜法；2-HBP；檢測

前言

2-羥基聯(lián)苯（2-biphenylol，2-HBP），又名鄰苯基苯酚、鄰苯基酚、（1,1’-二苯基）-2-酚、苯基苯酚?？捎米髯枞紕?、表面活性劑、殺菌防腐劑，還可用于醫(yī)藥、印染助劑和染料中間體，在日本，2-HBP及其鈉鹽用于柑桔的防霉，而英國、美國和加拿大允許使用的水果范圍較大，還包括蘋果、梨和菠蘿等[1～8]。另外，2-HBP還可以用于化妝品。美國環(huán)境保護(hù)局（EPA）允許使用以鄰苯基苯酚或其鈉鹽為主要成分的殺菌皂、殺菌除臭洗劑、防腐保鮮劑。目前，該化合物的生產(chǎn)都采用真空蒸餾法，而分析羥基聯(lián)苯類化合物通常需要繁瑣的前處理步驟，目前大多數(shù)采用比色法、同步熒光法、高效液相色譜法等。其中高效液相色譜法是最常用的方法[1,2]。

1 材料和方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基和試劑

菌種：具有降解二苯并噻吩（DBT）能力的菌株HNHHJ-1，分離自大慶油田井口附近含油土壤。

培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基由質(zhì)量濃度為8.0g/L葡萄糖，2.5g/LNH4Cl，6.5g/LKH2PO4，8.5g/LK2HPO4，0.3g/L MgCl2·6H2O，分別加入1.0mL/L微量元素溶液母液和維生素溶液母液，pH值7.0～7.2。微量元素母液由質(zhì)量濃度為 0.8g/L FeCl2·4H2O，0.8g/L ZnCl2，0.8g/L MnCl2·4H2O，0.2g/LNaMoO4·2H2O，0.08g/LCuCl2，0.08g/L NaWO4·2H2O和150mmol/LHCl組成。維生素母液由質(zhì)量濃度500mg/L泛酸鈣，300mg/L肌醇，500mg/L煙酸，500mg/L鹽酸吡哆醇，300mg/L對氨基甲苯和0.8mg/L維生素B12組成[2]。

選擇性培養(yǎng)基：將一定濃度的DBT加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

試劑：甲醇（HPLC），二苯并噻吩（DBT），葡萄糖，氯化銨，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，六水氯化鎂，四水氯化亞鐵，氯化鋅，四水氯化錳，二水鉬酸鈉，氯化銅，二水鎢酸鈉，鹽酸，泛酸鈣，肌醇煙酸，鹽酸吡哆醇，對氨基甲苯和維生素B12。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（包括Waters 510泵，柱溫箱，Waters PDA檢測器和Waters EmpowerTM）美國Waters公司；色譜柱（ACQVITY DPLC@BEH C18，50×2.1mm，1.7μm）美國Waters公司；超聲波清洗機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 超高效液相色譜條件

PDA檢測器，色譜柱為ACQVITY DPLC@BEH C18，柱溫30℃，流動相為甲醇∶水（90∶10，V/V），使用超聲脫氣，各樣品均用0.22μm濾膜過濾并經(jīng)過脫氣處理；流速0.2mL/min，進(jìn)樣量2μL。

1.3.2 待測樣品提取

在含有100mL分離培養(yǎng)基的250mL三角瓶中接種HNHHJ-1菌株，初始pH值7.0～7.2，培養(yǎng)溫度30℃、搖瓶轉(zhuǎn)速100r/min培養(yǎng)3d，用循環(huán)水真空過濾器進(jìn)行過濾，取200mL抽濾后的發(fā)酵液，加入等體積的正己烷，振蕩2min，充分混勻萃取兩次，合并正己烷，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷，蒸發(fā)瓶內(nèi)殘留物用甲醇定容至10mL，用UPLC樣品過濾專用濾膜過濾后，用超高效液相色譜分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液和曲線

二苯并噻吩（DBT）標(biāo)準(zhǔn)溶液：用分析天平稱量0.04gDBT，溶于100mL甲醇中，制得質(zhì)量濃度為400mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液;

2-羥基聯(lián)苯（2-HBP）標(biāo)準(zhǔn)儲備液：用分析天平稱量0.1g 2-HBP，溶于100mL甲醇中，制得質(zhì)量濃度為1000mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2-HBP標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別配制質(zhì)量濃度為10、15、20、40、60、80mg/L的2-HBP標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用UPLC進(jìn)行分析測定，每次進(jìn)樣量為2μL，以2-HBP濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

用稀釋20倍的2-HBP標(biāo)準(zhǔn)儲備液和質(zhì)量濃度為50mg/L的2-HBP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。分別吸取各溶液3份，用UPLC法進(jìn)行2-HBP含量測定，比較同一樣品6次檢測結(jié)果的差異。

1.3.5 回收率實(shí)驗(yàn)

分別將一定量的2-HBP對照溶液加入到已知濃度的2-HBP發(fā)酵液中進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行，用UPLC法進(jìn)行2-HBP含量測定，確定其回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 2-HBP超高效液相色譜檢測條件的確立

由于主要以發(fā)酵液中DBT的殘留量和2-HBP的生成量為檢測對象，故主要是以二者的分離情況作為是否能夠進(jìn)行檢測的標(biāo)準(zhǔn)。檢測結(jié)果顯示，當(dāng)流動相為甲醇∶水（10∶0，V/V）時(shí)（如圖1a），保留時(shí)間間隔太短，雖然二者峰型較好，但是分離效果不是很好；當(dāng)流動相為甲醇∶水（90∶10，V/V）時(shí)（如圖1b），DBT和2-HBP分離效果明顯，而且峰型也較好，當(dāng)流動相為甲醇∶水（80∶20，V/V）時(shí)（如圖1C），雖然DBT和2-HBP分離效果明顯，但峰型不是特別好，故選擇流動相的配比為甲醇∶水（90∶10，V/V）。

圖1 甲醇與水體積比對DBT（400mg/L）和2-HBP（200mg/L）在UPLC色譜中分離的影響Fig.1 The influence of methanol/water volume ratio on UPLC separation of DBT（400 mg/L）and 2-HBP（200 mg/L）

2.2 2-HBP保留時(shí)間的確定

將經(jīng)酸化及萃取處理后未接種的培養(yǎng)基，與200mg/L 2-HBP標(biāo)準(zhǔn)品混合進(jìn)樣，2-HBP的保留時(shí)間為0.73min（圖2）。

圖2 2-HBP（200mg/L）標(biāo)準(zhǔn)品UPLC色譜圖Fig.2 The 2-HBP（200 mg/L）standard UPLC chromatogram

2.3 2-HBP標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別在超高效液相色譜條件下對質(zhì)量濃度為10、15、20、40、60、80mg/L的2-HBP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測定，各質(zhì)量濃度均測定3次并取其平均值，以2-HBP質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明質(zhì)量濃度在0～80mg/L范圍內(nèi)曲線線性良好。2-HBP的質(zhì)量濃度和峰面積之間的相關(guān)方程為y=5427.2X-8406.5，R2=0.9997。

圖3 2-HBP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of 2-HBP

2.4 精密度和回收率

取3份50mg/L的2-HBP標(biāo)準(zhǔn)溶液用UPLC法進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.5%。分別加入一定量的2-HBP對照溶液到已知濃度的2-HBP發(fā)酵液中進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行，具體加入量及結(jié)果見表1。2-HBP的平均回收率為97.73%，RSD為0.28%（n=6）。

表1 檢測的2-HBP回收率（n=6）Table 1 The recovery rates of 2-HBP with different addition amounts（n=6）

2.5 HNHHJ-1降解DBT生成2-HBP測定

將HNHHJ-1以1%的接種量接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，取經(jīng)處理后的培養(yǎng)液進(jìn)行UPLC檢測分析，發(fā)現(xiàn)HNHHJ-1將DBT降解為2-HBP，超高效液相色譜顯示DBT及2-HBP保留時(shí)間分別為1.07min和0.74min,得到良好的分離（圖4），與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相符、且峰型好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和超高效液相峰面積（圖4）計(jì)算得出，此時(shí)培養(yǎng)液中2-HBP含量為5.35mg/L。

圖4 HNHHJ-1最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)液UPLC色譜圖Fig.4 The UPLC chromatogram of HNHHJ-1 broth under optimal culture conditions

3 結(jié)論

本研究得到的UPLC法檢測2-HBP的色譜條件為：以ACQVITYDPLC@BEH C18為色譜柱，流動相為甲醇∶水（90∶10，V/V），流速0.2mL/min，進(jìn)樣量 2μL，PDA檢測器。2-HBP的保留時(shí)間為0.74min，檢出線性范圍為范圍為0～80mg/L。利用該方法測定的HNHHJ-1菌株發(fā)酵液中的2-HBP的含量為5.35mg/L。

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Determination of 2-Hydroxybiphenyl Content in Fermentation Broth of Desulfurization Strain HNHHJ-1 by UPLC Method

ZHANG Yu,ZHANG Yue,MA Ning and WANG Zhi-cheng
（Institute of Energy&Environmental Research Heilongjiang Academy of Science,Harbin 150090,China）

The concentration of 2-hydroxybiphenyl（2-HBP）in the fermentation broth of desulfurization strain was determined byultra performance liquid chromatography（UPLC）.The 2-HBP was separated by a chromatographic column（2.1×50 mm,1.7μm,waters）,eluted with methyl alcohol and water with a volume ratio of 90∶10 at a flow rate of 0.2mL/min and detected with PDA detector;the column temperature was 30℃,and the sample quantity was 2μL.The results showed that the retention time of 2-HBP was 0.74min with a detection limit of 0～200mg/L.The 2-HBP concentration in the fermentation broth of strain HNHHJ-1 was 5.35mg/L.

UPLC;2-HBP；detection

O657.72

A

1001-0017（2017)01-0040-03

2016-10-09

黑龍江省青年科學(xué)基金（編號：QC2014C028）

張宇(1983－)，男，黑龍江肇州人，助理研究員，研究領(lǐng)域?yàn)榄h(huán)境與節(jié)能技術(shù)。

**通訊聯(lián)系人：王志成（1973-），男，黑龍江哈爾濱人，研究員級高級工程師，從事生物質(zhì)能源、替代能源和室內(nèi)環(huán)境研究。