酸漿果實中多酚的提取及其抗氧化能力研究

武乾英，王曉聞，郭瑜，許惠芳，王艷麗

（山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

酸漿果實中多酚的提取及其抗氧化能力研究

武乾英，王曉聞*，郭瑜，許惠芳，王艷麗

（山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

以酸漿果實為研究對象，對其多酚提取工藝進行優(yōu)化并分析其（Ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）還原亞鐵離子的能力）。采用響應面法對乙醇體積分數(shù)、料液比、溫度、提取時間進行優(yōu)化，確定酸漿果實多酚的最佳提取條件，并采用FRAP對多酚提取物的體外抗氧化能力進行分析。結(jié)果表明：酸漿果實多酚的最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)61.5%、料液比1∶15（g/mL）、浸提溫度59℃、提取時間102 min，所得多酚得率為0.899%DW，與預測值偏差不大。酸漿多酚10 mg/mL時FRAP值為0.495 mmol/L。研究表明酸漿果實中含有多酚類物質(zhì)，且具有一定的還原亞鐵離子的能力。

酸漿果實；多酚；提取；亞鐵離子還原能力

酸漿 [Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino]為茄科酸漿屬多年生草本植物，又名天泡果、燈籠草等，屬野生資源，目前被認為是一種具有較高營養(yǎng)價值的稀特果蔬[1]。酸漿的根及全草入藥，具有利咽、化痰、清熱、利尿等功能。由于其含有多種甾類化合物，所以中醫(yī)藥上可廣泛應用于解毒等[2]。

酸漿果實中含有豐富的常量元素及多種微量元素[3-4]。同時酸漿果實中含有豐富多種的植物化學成分，目前對酸漿的研究多集中在酸漿苦素、皂苷類及生物堿類的活性分析，然而酸漿果實中的多酚類物質(zhì)的研究甚少。

因此本研究采用響應曲面法對酸漿果實中多酚的提取條件進行優(yōu)化，并采用FRAP法分析其體外總抗氧能力，為提高酸漿的綜合利用率提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸漿果實粉末：酸漿果實采自山西省大同市陽高縣。將新鮮酸漿果實脫萼、除雜、清洗后，榨汁并冷凍干燥，經(jīng)粉碎、40目過篩即得酸漿果實粉末，置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

乙醇、乙醚、沒食子酸、碳酸鈉、FeSO4、醋酸緩沖液、鹽酸、三氯化鐵（均為AR級）；2，4，6－三吡啶基三嗪（TPTZ）、Folin－Ciocalteu：北京索萊寶科技有限公司。

JYZ－D51榨汁機：九陽股份有限公司；R－1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB－III循環(huán)水式真空泵、WB－200水浴鍋：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；BS210S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；JDG－0.2真空冷凍干燥機：蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制及多酚含量的測定

配制沒食子酸標準液濃度為0、20、40、60、80、100 μg/mL樣液。取樣液0.2 mL，加入2%Na2CO3溶液4 mL，福林試劑0.2 mL，搖勻置25℃恒溫水浴中放置30 min，765 nm下測定吸光值。得到吸光度值X與沒食子酸標準溶液濃度（Y，mg/mL）之間的回歸方程為：Y=0.033 54X－0.001 09，R2=0.999 52。

1.2.2 酸漿果實中多酚的提取及其測定

稱取1 g的酸漿果粉，按照一定的料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液（0%、20%、40%、60%、80%、100%），在一定溫度（20、30、40、50、60、70℃）下提取一定時間（40、60、80、100、120、140 min）后，離心除雜。收集上清液減壓濃縮，并用乙醚脫脂，采用福林酚法測定樣品中的多酚含量及其得率。將提取的酸漿果實多酚粗提液定容至100 mL，按照以上方法，取樣液0.2 mL，加入2%Na2CO3溶液4 mL，福林試劑0.2 mL，搖勻置25℃恒溫水浴中放置30 min，765 nm下測定吸光值，平行3次測定其吸光值，根據(jù)標準曲線測定其對應的多酚得率，結(jié)果按下式計算：

式中：W為多酚的得率，%；C為由粗提液測定吸光值后，在標準曲線中所對應沒食子酸質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液定容后的體積，100 mL；m為稱樣量，g。

1.2.3 單因素試驗及其響應曲面法確定最佳提取工藝

1.2.3.1 單因素試驗

以1.2.2中4組因素做單因素試驗，每組試驗平行進行3次，確定各因素適宜的范圍。

1.2.3.2 響應曲面法試驗設計確定最佳提取工藝

在單因素試驗基礎上，確定中心組合試驗設計的自變量及水平。根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗設計原理，以多酚含量為響應值，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取溫度4個因素，設計四因素三水平響應面分析試驗，用響應面分析方法對數(shù)據(jù)進行回歸分析及顯著性檢驗，來確定最佳工藝參數(shù)。

1.2.4 亞鐵離子還原能力分析法（FRAP）測定酸漿多酚抗氧化能力

FRAP工作液：2.5 mL10 mmol/L的TPTZ工作液（用40 mmol/L的鹽酸溶解），2.5 mL 20 mmol/L的FeCl3·6H2O和25 mL 0.3 mol/L的醋酸緩沖液（pH3.6）混合均勻即得。

配制1 mmol/L的FeSO4溶液。在0～400 μL范圍內(nèi)取不同體積于試管中，加蒸餾水到2 mL，用FRAP工作液加到5 mL，搖勻，在室溫放置30 min，在593 nm處測吸光值。以吸光值為縱坐標，F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標，得標準曲線回歸方程為Y=0.000 59X－0.012 31，R2= 0.996 42。

將多酚粗提物進行純化后（純度為58.33%）配制為溶液，取同樣體積的不同濃度多酚樣品溶液，加蒸餾水到2 mL處，再加FRAP工作液至5 mL，搖勻，室溫放置30 min，不加樣品改為加蒸餾水作為參照，在593 nm處測吸光值，每個平行測定3次，取平均值。由還原力標準曲線，得出相同吸光度值處FeSO4的濃度，將此濃度的數(shù)值作為FRAP值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對多酚提取效果的影響

2.1.1 乙醇濃度對酸漿多酚含量的影響

精確稱取1 g酸漿果粉，按照1∶15（g/mL）的料液比加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液（0%、20%、40%、60%、80%、100%），在60℃下提取100 min，乙醇濃度對酸漿多酚含量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對酸漿多酚得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction of polyphenols

由圖1可以看出，酸漿多酚提取量隨著乙醇體積分數(shù)的增大而先增加后減小，在60%時達到最大值，為7.654 mg/g，得率為0.765%。當乙醇濃度過高時，溶劑的極性過低，從而導致提取量下降，而且會導致酸漿苦素等其他物質(zhì)的提出，給之后的純化及其抗氧化試驗造成影響。因此，選擇60%的乙醇作為提取溶劑。后續(xù)響應面試驗乙醇體積分數(shù)確定為50%、60%、70%3個水平。

2.1.2 料液比對酸漿多酚濃度的影響

精確稱取1 g酸漿果粉，按照一定的料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入體積分數(shù)60%的乙醇溶液，在60℃下提取100 min，料液比對酸漿多酚含量的影響結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對酸漿多酚得率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction of polyphenols

由圖2可以看出，料液比在1∶10（g/mL）～1∶15（g/ mL）的范圍內(nèi)，多酚的提取量得到了明顯提高，將料液比繼續(xù)提高對酸漿多酚的提取量無顯著性影響。除此之外，料液比過大能夠造成資源的浪費。因此，最佳料液比為1∶15（g/mL）。后續(xù)響應面試驗料液比確定為1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）。

2.1.3 提取時間對多酚含量的影響

精確稱取1 g酸漿果粉，按照料液比1∶15（g/mL）加入體積分數(shù)60%的乙醇溶液，在60℃下提取一定時間（40、60、80、100、120、140 min），提取時間對酸漿多酚含量的影響結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間對酸漿多酚得率的影響Fig.3 Effect of time on the extraction of polyphenols

由圖3可以看出，在100 min內(nèi)，多酚提取量隨著時間的變長而增大，當提取時間為100 min時，提取量最大為8.712 mg/g，得率為0.871%。時間較短時，結(jié)合氫鍵不能完全被破壞，時間過長時，則會引起其中多酚的損失。后續(xù)響應面試驗提取時間確定為80、100、120 min。

2.1.4 提取溫度對多酚含量的影響

精確稱取1 g酸漿果粉，按照1∶15（g/mL）的料液比加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶液，在一定溫度（20、30、40、50、60、70℃）下提取100 min，提取溫度對酸漿多酚含量的影響結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對酸漿多酚得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction of polyphenols

由圖4可以看出，在30℃～60℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多酚提取量升高，在60℃達到最高點，提取量為8.318 mg/g，得率為0.832%。溫度進一步升高，高溫促使多酚類物質(zhì)的氧化變性，因此，多酚得率有著明顯的下降。因此，選擇60℃作為最佳提取溫度。后續(xù)響應面試驗確定提取溫度為50、60、70℃。

2.2 響應面分析

2.2.1 多元二次響應面回歸模型的建立

因素水平編碼見表1。試驗結(jié)果如表2。

表1 因素水平編碼表Table 1 The coding table of factors and levels

表2 響應面分析試驗設計與結(jié)果Table 2 The design and results of response surface experiments

續(xù)表2 響應面分析試驗設計與結(jié)果Continue table 2 The design and results of response surface experiments

2.2.2 方差分析與顯著性檢驗

通過Design Expert數(shù)據(jù)分析軟件進行回歸分析，得到的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

由表3可知，模型P＜0.05，該二次方程模型達到顯著水平，模型失擬項P值為0.120 7＞0.05，失擬項不顯著，說明其他情況對模型干擾程度小，該響應面回歸模型擬合度良好。在該模型中，對多酚含量有顯著影響的有 B、C、AD、A2、B2及D2，該模型信噪比為7.128，該值大于4則表明該模型可以用于預測，該模型擬合優(yōu)度R2和調(diào)整R2分別為0.145 8與0.569 8，兩者的差值在可以接受的范圍內(nèi)。對表2的試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到以乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度為自變量的四元二次回歸方程：

2.2.3 酸漿多酚提取量響應面分析

酸漿多酚提取量響應面分析見圖5。通過Box－Behnken試驗得到的多元二次回歸模型所作的響應面圖及其高線圖可用于評價試驗因素對酸漿多酚得率影響的兩兩交互作用以及確定各個因素的最佳水平范圍。

圖5 乙醇體積分數(shù)和提取溫度對酸漿多酚得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface contour plots showing the effects of ethanol concentration and temperatureon the extraction of polyphenols

圖5表明，固定乙醇體積分數(shù)、多酚得率隨著提取溫度的升高而增加，但是溫度過高容易使多酚發(fā)生氧化，從而降低得率；固定提取溫度，多酚得率隨乙醇體積分數(shù)的增加先增加后減小。

通過數(shù)據(jù)分析，提取酸漿多酚最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)61.53%、料液比1∶15.28（g/mL）、浸提溫度58.93℃、提取時間102.35 min，多酚的提取量為9.048 mg/g，得率為0.905%。考慮到可操作性，將條件調(diào)整為乙醇體積分數(shù)61.5%、料液比1∶15（g/mL）、浸提溫度59℃、提取時間102 min，進行驗證試驗得到多酚含量為8.986 mg/g，得率為0.899%。與理論值基本相符，進一步驗證了回歸模型的可靠性，因此響應面法對酸漿多酚提取的條件優(yōu)化是可行的。

2.3 FRAP法測定酸漿多酚提取物抗氧化能力

不同濃度酸漿多酚及其對應的FRAP值如圖6所示。

圖6 多酚濃度與FRAP值的相關(guān)性Fig.6 The correlation between the polyphenols and ferric reducing antioxidant power

從圖6可以看出，隨著酸漿多酚濃度的增加，F(xiàn)RAP值也在不斷增加，即抗氧化活性不斷增加。酸漿多酚還原亞鐵離子的能力與其濃度總體呈依賴關(guān)系。當酸漿多酚濃度為10 mg/mL時FRAP值為0.495 mmol/mL，表明其有潛在的體外抗氧化能力。

3 結(jié)論

經(jīng)優(yōu)化后，酸漿多酚的提取條件為乙醇體積分數(shù)61.5%、料液比1∶15（g/mL）、浸提溫度59℃、提取時間102 min，進行驗證試驗得到多酚含量為8.986 mg/g，得率為0.899%，與理論值基本相符，進一步驗證了回歸模型的可靠性。之后將酸漿多酚粗提物純化后純度為58.33%。同時研究表明酸漿多酚濃度為10 mg/mL時FRAP值為0.495 mmol/mL，對亞鐵離子有一定的還原能力，該提取物具有一定的體外抗氧化能力。

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Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Physalis alkekengi Fruit

WU Qian-ying，WANG Xiao-wen*，GUO Yu，XU Hui-fang，WANG Yan-li
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，Shanxi，China）

The optimal extraction conditions and FRAP（ferric reducing antioxidant power）of polyphenols from Physalis alkekengi L.vdx.franchetii（Mast）Makino fruit were investigated.Response surface methodology was employed to optimize extraction process of polyphenols from P.alkekengi fruit by taking ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction temperature and extraction time as factors，and its antioxidant activity was investigated by observing its FRAP.The optimized conditions were as follows：the ethanol concentration was 61.5%，theproportionofsolid-liquidwas1∶15（g/mL），theextractiontemperaturewas59℃，andtheextractiontime was 102 min.Under the optimal conditions，the maximum extraction amounts of polyphenols was 0.899%DW.For polyphenols from P.alkekengi fruit，the maximum FRAP value was 0.495mmol/L at a concentration of 10 mg/mL.The results demonstrated that P.alkekengi fruit rich in polyphenols had a certain in ferric reducing antioxidant power.

Physalis alkekengi fruit；polyphenols；extraction；ferric reducing antioxidant power

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.008

2016-08-19

山西省國際科技合作項目（2015081024）；山西省科技攻關(guān)項目（20150311020-2）；山西省回國留學人員科研資助項目（2016-073）

武乾英（1991—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。

*通信作者：王曉聞（1968—），女（漢），教授，碩士生導師，博士，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。