幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究進展

楊倩，劉建輝，蔣彤，董莉莉，段宏玉，孫紀(jì)錄

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北滄州061100；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究進展

楊倩1，劉建輝1，蔣彤1，董莉莉1，段宏玉1，孫紀(jì)錄2，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北滄州061100；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

幾丁質(zhì)脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）是可以催化幾丁質(zhì)脫乙?；磻?yīng)生成殼聚糖的酶類。殼聚糖因其具有抗菌、抗癌、抗病毒等特性，在醫(yī)藥、化工、食品等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。對CDA的研究概況進行了綜述，包括酶學(xué)性質(zhì)、催化機理、分離純化的方法等，同時對CDA產(chǎn)生菌的篩選方法及過程做了簡要的闡述，并對CDA今后的重點研究方向進行了展望。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶；幾丁質(zhì)；殼聚糖；脫乙酰

幾丁質(zhì)又稱甲殼素，是由N－乙酰－D－葡萄糖胺以β－1，4糖苷鍵連接而成的天然高分子多糖，在自然界中含量僅次于纖維素。但由于其溶解性差，應(yīng)用受到一定限制[1]。幾丁質(zhì)的衍生物殼聚糖，又稱脫乙酰甲殼素，是天然多糖中唯一大量存在的堿性氨基多糖。殼聚糖具有抗菌、抗癌、抗病毒等作用，并且具有良好的生物相容性和生物可降解性，在醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用[2]。目前，生產(chǎn)殼聚糖主要是采用化學(xué)方法?；瘜W(xué)方法需要使用大量的濃堿，除反應(yīng)時間長、成本高、耗能大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點外，反應(yīng)過程中生成的某些有毒的物質(zhì)（如肼等），也會對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染[3]。而采用生物酶法降解幾丁質(zhì)可以克服化學(xué)方法的缺點。幾丁質(zhì)脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）是催化幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為殼聚糖的關(guān)鍵酶，能夠脫去幾丁質(zhì)分子中的乙酰基生成殼聚糖。本文針對幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究概況進行綜述，以期為后續(xù)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的進一步研究與應(yīng)用提供理論支持。

1 CDA的研究概況

1.1 CDA的酶學(xué)性質(zhì)

由于CDA的來源不同，其酶學(xué)性質(zhì)也存在差異性。到目前為止，自然界所發(fā)現(xiàn)的CDA都是糖蛋白。CDA熱穩(wěn)定性良好，大多數(shù)CDA的最適溫度為50℃～60℃。而最適pH差異較大，一般胞外酶的最適pH為7～12，胞內(nèi)酶最適pH為4.5～6。大部分CDA的等電點（isoelectric point，pI）都在酸性范圍內(nèi)[3－4]。影響CDA酶學(xué)性質(zhì)的因素主要有溫度、pH、底物狀態(tài)及濃度、相對分子質(zhì)量和金屬離子等。不同金屬離子對CDA酶學(xué)性質(zhì)的影響不同，同種金屬離子也可能因其濃度不同而起相反的作用，比如對于紅球菌（Rhodococcus）所產(chǎn)的CDA，高濃度的Ca2+、Mn2+、K+抑制其酶活，而低濃度的Ca2+、Mn2+、K+卻是該酶的激活劑[5]。表1列舉了不同來源CDA的性質(zhì)。

表1 不同來源CDA的性質(zhì)Table 1 The property of the CDA from different sources

1.2 CDA的催化機理

在關(guān)于CDA催化機理的研究中，Martinou等以魯氏毛霉（Mucor rouxii）中的CDA為樣本，通過1HNMR和13CNMR光譜檢測，發(fā)現(xiàn)CDA水解乙?；姆磻?yīng)是多位點進攻模式，即可同時脫除多個位點的乙?；?，脫除乙?；膫€數(shù)與作用點的個數(shù)有關(guān)[12]。CDA的作用機制與其他酶作用于多聚體底物的作用機制相近。據(jù)測試結(jié)果合理推測其水解過程可能為：CDA與幾丁質(zhì)的N－乙酰－D－葡萄糖胺長直鏈結(jié)合，從結(jié)合位點的非還原端開始水解，依次脫除乙?；瓿珊笈c長鏈脫離，再結(jié)合另一條長鏈繼續(xù)作用[13－14]。此外，來源于菜豆炭疽菌的CDA可將殼二糖乙?；?－乙酰氨基－2－脫氧－D－吡喃葡萄糖－（1→4）－2－氨基－2－脫氧－D－葡萄糖，這是一種不常見的特殊催化產(chǎn)物。該CDA在3 mol/L乙酸鈉存在下，可以催化逆向脫乙酰反應(yīng)[15]。

1.3 CDA的分離純化

純化CDA常用的方法主要為層析法。Kafetzopoulos等采用3步層析法將魯氏毛霉的粗酶提取物進行純化。純化倍數(shù)為97.3，得率11.9%，酶的比活力為2.968U/mg[16]。Tokuyasu等[17]對菜豆炭疽菌產(chǎn)生的粗酶提取物同樣通過3步層析法進行純化，達到電泳純。純化倍數(shù)為944、得率為4.05%、酶的比活力為18.4 U/mg[17]。Jeraj等將黑根霉（Rhizopus nigricans）的粗酶提取物采用2步層析法，分別通過CM凝膠色譜柱和DEAE－纖維色譜柱進行分離純化，達到電泳純。純化倍數(shù)為21.2、得率為5.2%、比活力為40.3 U/mg[18]。Pareek等將草酸青霉的粗酶液通過2步層析法對CDA進行了純化，達到電泳純。純化倍數(shù)為88.25、得率為11.06%、比活力為55.38 U/mg[11]。

1.4 產(chǎn)CDA的微生物種類

CDA在1974被首次報道，是由Araki和Ito在魯氏毛霉中發(fā)現(xiàn)的[19]，之后研究者們又在一些致病的真菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了CDA的存在[20]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的微生物種類較為廣泛，主要有細(xì)菌、放線菌、真菌等。部分重要的產(chǎn)CDA的微生物列于表2中。

表2 產(chǎn)CDA的微生物Table 2 The microorganisms producing CDA

2 產(chǎn)CDA微生物的篩選

篩選過程一般分為初篩和復(fù)篩。初篩是從平板篩選培養(yǎng)基上篩選得到可疑菌落，復(fù)篩即進一步確認(rèn)可疑菌株是否能產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶并測定其酶活力。

2.1 初篩的方法及過程

2.1.1 初篩的方法

初篩的方法主要有兩種。一是透明圈法，其原理是以膠體幾丁質(zhì)作為唯一氮源制成平板篩選培養(yǎng)基，如果有能產(chǎn)生CDA的菌存在，便可以分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生透明圈。通過透明圈的大小判斷微生物對幾丁質(zhì)的分解能力和CDA的活性。此法的不足之處在于：膠體幾丁質(zhì)的平板是半透明的，所以觀察效果并不明顯[32]。二是變色圈法，其原理是將對硝基乙酰苯胺作為平板篩選培養(yǎng)基的底物之一，可以脫去幾丁質(zhì)乙?；奈⑸镆部梢悦撊ο趸阴１桨飞系囊阴；?，生成黃色的對硝基苯胺，這樣就可以通過平板篩選培養(yǎng)基上是否出現(xiàn)黃色以及黃色面積的大小來判斷是否有產(chǎn)生CDA的微生物存在和其脫乙?；哪芰Υ笮?。此法反應(yīng)現(xiàn)象明顯，易于觀察，缺點在于對硝基乙酰苯胺有毒，難溶于冷水，高溫易分解，不易操作。

2.1.2 初篩的過程

根據(jù)實際情況采樣，采樣后應(yīng)盡快進行富集培養(yǎng)，一般富集培養(yǎng)時間為3 d～7 d，再進行平板篩選，從平板篩選培養(yǎng)基上挑選可疑菌落進行劃線分離純化培養(yǎng)，最后接種到斜面培養(yǎng)基上進行保存。

2.2 復(fù)篩的方法及過程

2.2.1 CDA酶活力測定方法

由于天然幾丁質(zhì)不溶于水，需經(jīng)特殊處理后才能用作酶活力測定的底物。因此，CDA酶活力測定受到限制，使得CDA的研究進展緩慢。以下介紹幾種已報道的CDA酶活力測定方法。

2.2.1.1 比色法

CDA催化膠體幾丁質(zhì)生成葡萄糖胺單體，再利用吲哚－鹽酸分光光度法測定反應(yīng)終產(chǎn)物中糖胺的含量，計算CDA的酶活力[33]。其實驗原理是使用亞硝酸鹽脫除己糖胺的氨基生成己糖苷，吲哚與產(chǎn)物己糖苷在鹽酸溶液中發(fā)生顏色反應(yīng)，通過測定顏色反應(yīng)前后的吸光值，即可得出反應(yīng)前后乙?；拿摮俊１壬▽嶒灲Y(jié)果存在重現(xiàn)性較差的缺點。

2.2.1.2 放射法

其原理是將可溶性幾丁質(zhì)中的乙?；梅派湫晕镔|(zhì)進行標(biāo)記，將其作為底物應(yīng)用CDA進行催化，反應(yīng)結(jié)束后通過測定其中放射性乙酸的含量計算出CDA的催化效率。放射法存在成本高、操作繁瑣、耗時長等缺點[15]。

2.2.1.3 對硝基乙酰苯胺分光光度法

將對硝基乙酰苯胺作為反應(yīng)底物，經(jīng)CDA催化后生成對硝基苯胺。使用分光光度法測定反應(yīng)后對硝基乙酰苯胺的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，從而計算出CDA的酶活。此法操作簡單、準(zhǔn)確度高，適合從大批量樣品中篩選目標(biāo)菌株[34]。

2.2.2 復(fù)篩的過程

將初篩得到的菌株接種到相應(yīng)的種子培養(yǎng)基，進行搖床培養(yǎng)，使其在種子培養(yǎng)基中能夠恢復(fù)活力并提前適應(yīng)發(fā)酵條件。然后將種子培養(yǎng)液接種到相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基能提供給其較適宜的發(fā)酵產(chǎn)酶條件。培養(yǎng)適當(dāng)時間后即可測其酶活力。

3 結(jié)論與展望

雖然幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究目前取得了一定進展，但同時也存在許多問題。

3.1 在CDA的分離純化與催化機理方面

目前關(guān)于CDA分離純化的研究還比較少，分離純化方法單一，主要是層析法。隨著科學(xué)技術(shù)的進步應(yīng)不斷簡化，以有利于實現(xiàn)CDA的工業(yè)化生產(chǎn)。CDA的催化機理的研究對其工業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要，因此可以將此列為研究方向進行深入探究。

3.2 在篩選產(chǎn)CDA的微生物的研究方面

目前已在多種菌屬中篩選到能產(chǎn)CDA的菌。但是，由于篩選出來的產(chǎn)CDA的菌株大多活力不高，發(fā)酵提取的條件不成熟，調(diào)控機理尚未研究清楚，不能應(yīng)用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。因此，通過誘變育種和分子生物學(xué)方法，選育和構(gòu)建具有穩(wěn)定遺傳性狀的CDA高產(chǎn)菌株仍是未來重要研究方向。另外，天然幾丁質(zhì)不能作為篩選產(chǎn)CDA菌的底物，因其晶體結(jié)構(gòu)難以進行脫乙?；磻?yīng)，必須將其經(jīng)過預(yù)處理。因此，研究幾丁質(zhì)簡單快速的預(yù)處理方法，破壞其晶體結(jié)構(gòu)也是今后研究的一個重點。

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Research Advance of Chitin Deacetylase

YANG Qian1，LIU Jian－h(huán)ui1，JIANG Tong1，DONG Li－li1，DUAN Hong－yu1，SUN Ji－lu2，*
（1.College of Science and Technology，Hebei Agricultural University，Cangzhou 061100，Hebei，China；2.College of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，Hebei，China）

Chitin deacetylase（CDA）is an enzyme which can catalyze deacetylase reaction in chitin generating chitosan.Chitosan has several excellent properties，such as antibacterial，anticancer，and antiviral，with wide application prospect in the medicine，chemical，and food industries.The research situation of CDA was reviewed，including enzymatic properties，catalytic mechanism，the method of separation and purification，etc. Furthermore，the screening methods and process of CDA producing strains were briefly introduced，and the future research direction of CDA was prospected.

chitin deacetylase；chitin；chitosan；deacetylation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.045

2016-08-25

河北省科技計劃項目“利用蟹殼和小球藻生產(chǎn)新型海洋多糖的關(guān)鍵技術(shù)研究及功能食品開發(fā)”（15273204D）

楊倩（1986—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品安全。*通信作者：孫紀(jì)錄（1972—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。