響應(yīng)面法優(yōu)化北五味子水溶性糖蛋白提取工藝

劉暢，田雙，楊洋，趙武，邵帥，嚴銘銘

（長春中醫(yī)藥大學，吉林長春130117）

響應(yīng)面法優(yōu)化北五味子水溶性糖蛋白提取工藝

劉暢，田雙，楊洋，趙武，邵帥*，嚴銘銘*

（長春中醫(yī)藥大學，吉林長春130117）

為探討堿提酸沉法提取北五味子水溶性糖蛋白的最優(yōu)條件，采用響應(yīng)面分析法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇料液比、浸提時間、浸提溫度和堿提液pH值為影響因素，以蛋白得率和糖得率為響應(yīng)值，采用中心組合Box-Benhnken法建立數(shù)學模型，進行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明，堿提酸沉法提取北五味子水溶性糖蛋白的最佳工藝條件為：料液比1∶35（g/mL），堿提液pH 9.5，浸提溫度35℃，浸提時間3 h，該條件下蛋白質(zhì)得率為7.72%，糖得率為19.24%。

北五味子；水溶性糖蛋白；提取；響應(yīng)面分析

糖蛋白是一種結(jié)合蛋白，由短的寡糖鏈與蛋白質(zhì)共價相連構(gòu)成的分子，以蛋白質(zhì)為主，通過共價鍵與若干短的寡糖鏈相連，其總體性質(zhì)更接近蛋白質(zhì)[1]。隨著糖生物學的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)作為糖綴合物的糖蛋白，表現(xiàn)出許多重要的生物學功能，具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、調(diào)節(jié)免疫、防衰老、降血脂、降血糖[4]等功效。植物源性的糖蛋白具有來源豐富、易獲得、成本低等特點。植物糖蛋白的一些生物活性具有較高的利用價值，在生化、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到了越來越多的認可[5]，因此植物中的糖蛋白也成為了當今研究的熱點之一。

五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實，習稱“北五味子”。北五味子主產(chǎn)地為遼寧、黑龍江、吉林等，本草中列為上品，認為有益氣、明目、補不足、養(yǎng)五臟、壯筋骨的作用，且具有滋腎斂肺、生津收汗、澀精、安神之功能[6]。目前，針對北五味子的開發(fā)利用研究主要集中在木脂素類、多糖類、揮發(fā)油類等方面，對北五味子糖蛋白及其生物活性的研究國內(nèi)外尚未報道。因此，本文采用響應(yīng)面分析法對北五味子水溶性糖蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，確定最佳工藝參數(shù)，旨在為提高北五味子資源的綜合利用及深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子：采于吉林省長白山，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學藥學院姜大成教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisan－dra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實。

Bradford蛋白濃度測定試劑盒：天根生化科技有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉、濃鹽酸：國產(chǎn)分析純。

TDL-5型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；S82-2型磁力攪拌器：上海志威電器有限公司；UB-7型pH計：美國丹佛儀器公司；UV-1700型紫外-可見分光光度計：日本島津；FDU-1200型冷凍干燥機：東京理化；KYH-111型高級商用沙冰料理機：中山市快特電器有限公司；MiniSpin Plus型超高速小型離心機：德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 分析測定方法

1.2.1.1 糖蛋白中蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍Bradfrod法測定糖蛋白中蛋白質(zhì)的含量。牛血清蛋白標準曲線的繪制：各取0、10、20、30、40、50、60 μL牛血清白蛋白標準溶液（1 mg/mL），用PBS補足到150 μL后，加入2.85 mL考馬斯亮藍染液，混勻，室溫放置5 min，在可見-紫外分光光度計595 nm處測定吸光度值，以牛血清蛋白質(zhì)量（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線。稀釋后的樣品溶液用上述方法測定，由標準曲線求得其質(zhì)量濃度。

1.2.1.2 糖蛋白中多糖含量的測定[7]

采用苯酚-濃硫酸法測定糖蛋白中多糖的含量。葡萄糖標準曲線的繪制：將葡萄糖配制成0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，分別取1、2、3、4、5mL定容至10mL，再從中取出1 mL，加質(zhì)量分數(shù)5%苯酚1 mL，5 mL濃硫酸，渦旋混勻，室溫放置30 min。于波長490 nm處測定吸光度值，以葡萄糖標準溶液濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線。稀釋后的樣品溶液用上述方法測定，由標準曲線求得其質(zhì)量濃度。

1.2.1.3 蛋白質(zhì)與糖得率的計算

式中：r為蛋白或糖得率，%；C為測得樣品溶液的蛋白質(zhì)或糖質(zhì)量濃度，μg/mL；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；V為樣品溶液的體積，mL；m為五味子樣品的質(zhì)量，g。

1.2.2 北五味子水溶性糖蛋白的提取工藝流程

五味子干燥果實→按照一定料液比勻漿→用1 mol/LNaOH將堿提液調(diào)至一定pH值→在一定溫度下，浸提一定時間→離心→上清液→酸沉→離心→沉淀物冷凍干燥→北五味子水溶性糖蛋白

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

以蛋白質(zhì)及糖的得率為研究指標，以料液比、浸提時間、浸提溫度、堿提液pH值為影響因素，對北五味子水溶性糖蛋白提取工藝進行單因素試驗。分別考察料液比[1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）]、浸提時間（1、2、3、4、5 h）、浸提溫度（4、25、35、45、55℃）和堿提液pH值（8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）對北五味子水溶性糖蛋白提取效果的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法中Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，以料液比（A）、堿提液pH（B）、浸提溫度（C）和浸提時間（D）為自變量，蛋白得率（Y1）和糖得率（Y2）為響應(yīng)值，采用Box－Benhnken中心組合模型進行響應(yīng)面分析，試驗因素水平編碼見表1。

表1 Box－Benhnken試驗因素水平表Table 1 Box－Benhnken test factor－levels table

2 結(jié)果與分析

2.1 牛血清白蛋白標準曲線

牛血清白蛋白標準曲線見圖1。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 The standard curve of bovine serum protein

由圖1可見，標準曲線的回歸方程為：y=0.002x+ 0.069 1（R2=0.998 2），蛋白在66.67 μg/mL～400 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。根據(jù)樣品溶液的吸光度值，對應(yīng)牛血清蛋白標準曲線，可以計算蛋白含量，進一步可計算蛋白得率。

2.2 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線見圖2。

由圖2可見，標準曲線的回歸方程為：y=0.013 2x-0.034 4（R2=0.992 9），葡萄糖在10 μg/mL～50 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。根據(jù)樣品溶液的吸光度值，對應(yīng)葡萄糖標準曲線，可以計算多糖含量，進一步可計算糖的得率。

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 The standard curve of glucose

2.3 北五味子水溶性糖蛋白提取工藝參數(shù)單因素試驗

2.3.1 不同料液比對提取效果的影響

當浸提溫度25℃、提取時間2 h，pH為10時，以料液比為變量進行3次平行試驗，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對蛋白與糖得率的影響Fig.3 Effect of solid/solvent ratio on yield of protein and saccharide

由圖3可知，蛋白與糖的得率隨著料液比的增加而逐漸升高，可能是隨著料液比的增加，糖蛋白得以充分的溶脹，當料液比超過1∶35（g/mL）后，蛋白與糖得率曲線接近水平，蛋白與糖得率隨料液比升高而增加緩慢，考慮到資源的合理利用和后期樣品回收等因素，料液比不宜選擇過大。因此，料液比以1∶35（g/mL）為宜。

2.3.2 不同堿提液pH值對提取率的影響

固定料液比1∶35（g/mL），浸提溫度25℃、提取時間2 h，以堿提液pH值為變量進行3次平行試驗，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，由于pH值的改變可以使蛋白質(zhì)的帶電情況發(fā)生改變，進而影響蛋白質(zhì)之間，以及蛋白質(zhì)和水之間的相互作用。北五味子水溶性糖蛋白的等電點偏低，因此合適的堿提液對糖蛋白的提取更加有利，隨著pH值的增加，提取率也逐漸增大，但是過高的pH值容易使蛋白變性。另外，在試驗中發(fā)現(xiàn)，pH值的改變會影響所提取的五味子水溶性糖蛋白的顏色，而且隨著pH值的增大顏色也越深，pH值在9～10范圍內(nèi)時顏色較淺。綜合考慮，堿提液pH以9.5為宜。

圖4 堿提pH值對蛋白與糖得率的影響Fig.4 Effect of pH on yield of protein and saccharide

2.3.3 浸提溫度對提取率的影響

固定料液比1∶35（g/mL），堿提液pH 9.5，提取時間2 h，以浸提溫度為變量進行3次平行試驗，結(jié)果見圖5。

圖5 浸提溫度對蛋白與糖得率的影響Fig.5 Effect of temperature on yield of protein and saccharide

由圖5可知，隨著溫度的升高，糖蛋白的得率也隨之增加，在35℃時蛋白及糖的得率達到最大，再升高溫度蛋白及糖的得率迅速減小，這是由于溫度過低時蛋白不能充分的溶解在提取溶劑中；溫度過高又極易引起蛋白質(zhì)的變性。因此，初步確定浸提溫度為35℃。

2.3.4 浸提時間對提取率的影響

固定料液比1∶35（g/mL），堿提液pH 9.5，浸提溫度為35℃，以浸提時間為變量進行3次平行試驗，結(jié)果見圖6。

圖6 浸提時間對蛋白與糖得率的影響Fig.6 Effect of time on yield of protein and saccharide

由圖6可知，在1 h～3 h范圍內(nèi)，隨著勻漿后的五味子被堿液充分浸提，使得溶出率也隨之增加，蛋白及糖的得率逐漸上升。在3 h之后蛋白及糖的得率增加緩慢，這是由于時間的增長能促進顆粒胞膜的破裂，有利于蛋白質(zhì)和糖的析出，但是當時間達到一定后，提取液中的有效成分濃度基本達到平衡，對蛋白及糖的得率影響較小，因此最佳的浸提時間為3 h。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化北五味子水溶性糖蛋白的提取工藝

2.4.1 回歸模型的建立與數(shù)據(jù)分析

按照試驗設(shè)計方案進行試驗，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 The experiment result of response surface

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Continue table 2 The experiment result of response surface

應(yīng)用Design－Expert 8.0.5b軟件對表2中蛋白質(zhì)得率和糖得率進行回歸擬合，得到二次回歸方程。其中，蛋白質(zhì)得率的回歸方程為：

糖得率的回歸方程為：

對試驗所得數(shù)據(jù)模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗方差分析Table 3 Variance analysis of response surface

蛋白質(zhì)得率和糖得率方程的模型顯著性P＜0.0001，是極顯著的，說明方程有意義，而蛋白質(zhì)得率和糖得率的失擬項P值分別為0.343 5、0.694 3，差異不顯著（P＞0.05），即模型與試驗的差異較小，說明其他因素對試驗結(jié)果的干擾較小，殘差由隨機誤差引起，能充分反映各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。另外蛋白質(zhì)得率與糖得率回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.939 1和0.985 8，均大于0.9，說明預測值與試驗值有較好的相關(guān)性，因此可以用回歸方程對試驗結(jié)果進行分析和預測[8]。

同時，通過方程發(fā)現(xiàn)各種因素之間存在著一定的交互作用，其中蛋白質(zhì)得率回歸方程A、B、C、AC、B2、C2、D2均呈極顯著影響（P＜0.01），D呈顯著影響（P＜0.05），糖得率回歸方程A、B、C、D、AC、A2、B2、C2、D2均呈極顯著影響（P＜0.01），BC呈顯著影響（P＜0.05）。

由方程的一次項系數(shù)可以得出，影響堿提酸沉法提取北五味子水溶性糖蛋白得率的因素的主次順序為料液比（A）＞浸提溫度（C）＞堿提pH值（B）＞浸提時間（D）。

2.4.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析見圖7。

圖7 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Responsive surface of interaction between factor

運用回歸模型得出北五味子水溶性糖蛋白的最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶35.00（g/mL），堿提液pH 9.69，浸提溫度34.40℃，浸提時間3.09 h，得到的蛋白質(zhì)得率為7.91%，糖得率為19.35%。

2.4.3 驗證試驗

考慮到實際操作的要求，將響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳提取工藝條件修正為：料液比1∶35（g/mL），堿提液pH9.5，浸提溫度35℃，浸提時間3 h。經(jīng)過3組平行試驗，得到的蛋白質(zhì)得率為7.72%，糖得率為19.24%，接近于最優(yōu)條件的預測值，因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準確可靠，有很好的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

使用響應(yīng)面法試驗設(shè)計，克服了正交設(shè)計只能處理離散的水平值，而無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷，并能減少試驗次數(shù)，分析幾種因素間的交互作用，以達到較全面地反映各因素水平的效果[9－12]。本試驗利用響應(yīng)面法對北五味子水溶性糖蛋白的提取條件進行優(yōu)選，首先考察了單因素料液比、浸提時間、浸提溫度和堿提液pH值對北五味子水溶性糖蛋白提取效果的影響，最終確定最佳提取工藝條件為：堿提液pH9.5，料液比1∶35（g/mL），浸提溫度35℃，浸提時間3 h，得到的蛋白質(zhì)得率為7.72%，糖得率為19.24%。

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Optimization of Extraction Process for Water-soluble Glycoprotein from Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.by Response Surface Analysis

LIU Chang，TIAN Shuang，YANG Yang，ZHAO Wu，SHAO Shuai*，YAN Ming-ming*
（Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China）

To optimize alkali extraction and acid precipitation process of water-soluble glycoprotein from Schisandra chinensis（Turcz.）Baill..On the basis of one-factor-at-a-time experiments，a mathematical model describing the effects of solid/solvent ratio，pH，temperature and time on yield of protein and saccharide were created using Box-Behnken experimental design and analyzed by response surface methodology.The optimum conditions for extracting water-soluble glycoprotein from Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.were determined as 1∶35（g/mL），pH 9.5，35℃and 3 h for solid/solvent ratio，pH，temperature and time，respectively.Under these conditions，the maximum theoretical extraction yield of protein was 7.72%，saccharide was 19.24%.

Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.；water-soluble glycoprotein；extraction；response surface optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.009

2016-09-02

吉林省重點科技攻關(guān)項目（20140204070YY）；吉林省教育廳“十三五”科學技術(shù)研究項目（2016024）

劉暢（1993—），女（漢），在讀碩士，從事中藥化學及新藥開發(fā)研究。

*通信作者：邵帥，副教授，博士，從事藥物化學、中藥化學及保健食品研究；嚴銘銘，教授，博士，從事藥物化學、中藥化學及新藥開發(fā)研究。