黃 杰，岳豐雄，徐宏軍

(成都天邦生物制品有限公司，四川成都 610100)

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牛病毒性腹瀉病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

黃 杰，岳豐雄*，徐宏軍

(成都天邦生物制品有限公司，四川成都 610100)

為了建立一種快速、特異、靈敏的檢測牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)TaqMan實時熒光定量RT-PCR的方法，根據(jù)NCBI GenBank上已公布的BVDV、豬瘟病毒(CSFV)核酸序列進(jìn)行比對，利用Oligo 6.71軟件設(shè)計一對引物及一條探針，建立了檢測BVDV的TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法。通過對該方法的特異性、重復(fù)性及其敏感性進(jìn)行相關(guān)試驗，結(jié)果表明該方法檢測出BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株Oregon C24V為陽性，豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和CSFV的檢測均為陰性。對BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株最低檢測量達(dá)到10-2.5TCID50。該方法檢測同一樣品重復(fù)進(jìn)行8次檢測，結(jié)果均一致，表明方法的重復(fù)性較好。應(yīng)用該方法對6批豬瘟疫苗專用血清進(jìn)行BVDV檢測，陽性率為16.7%；豬瘟弱毒苗中未檢出BVDV。建立的BVDVTaqMan實時熒光定量RT-PCR方法為生產(chǎn)無BVDV污染的豬瘟苗提供了有力的保障。

牛病毒性腹瀉病毒；實時熒光定量RT-PCR；豬瘟病毒；疫苗

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)，又稱牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVD-MDV)，屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員[1-3]。該病毒與豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、綿羊邊界病毒(Border disease virus,BDV)及長頸鹿瘟病毒(Pestivirus of giraffe)同屬[4-5]。BVDV主要感染牛，引發(fā)傳染性牛病毒性腹瀉病，主要臨床癥狀為腹瀉、黏膜糜爛潰瘍，咳嗽及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出死胎和畸形胎，持續(xù)感染(PI)及免疫抑制等，給養(yǎng)牛業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。該病毒除感染牛外，還可以感染駱駝、山羊、綿羊、鹿、豬等[6,8]。研究表明BVDV能突破宿主特異性發(fā)生交叉感染[9]，因此，豬瘟弱毒疫苗在生產(chǎn)中使用的牛血清、細(xì)胞、胰酶等材料中若含有BVDV病原，會導(dǎo)致疫苗污染，從而影響豬瘟疫苗的質(zhì)量[10]。

國內(nèi)外對豬瘟疫苗原材料中檢測BVDV的方法主要有Vero傳代細(xì)胞檢測法、致細(xì)胞病變和紅細(xì)胞吸附外源病毒檢驗法、熒光抗體檢測法、RT-PCR法[11]和實時熒光定量RT-PCR法[12-14]。每種方法均具有其優(yōu)缺點，本研究目的在于建立一種快速、特異、靈敏的檢測牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法，為生產(chǎn)無BVDV污染的豬瘟弱毒疫苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 BVDV(Oregon C24V株)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和CSFV(C株)毒株，均由成都天邦生物制品有限公司保存。

1.1.2 引物和探針設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中已公布的CSFV及BVDV核酸序列以及已發(fā)表的BVDV RT-PCR檢測方法相關(guān)專利和文章，利用DNA Star軟件進(jìn)行序列分析，再利用Oligo 6.71設(shè)計一對引物及探針用于鑒定BVDV及CSFV病毒(見表1),其擴(kuò)增目的片段大小為156 bp。引物由上海英駿公司合成，探針由ABI公司合成，引物及探針濃度稀釋成10 μmol/L，置-20℃保存。

1.1.3 主要試劑 One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)購自寶生物工程(大連)有限公司；病毒RNA提取試劑盒、病毒DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒模板的制備 按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取BVDV、CSFV、TGEV、PEDV和PRRSV病毒的總RNA以及病毒DNA提取試劑盒說明書提取PRV和PCV2的總DNA，為后續(xù)檢測提供模板。

表1 引物及探針序列

1.2.2 RT-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系 為了達(dá)到最優(yōu)的BVDV RT-PCR檢測結(jié)果，分別對其引物探針及濃度進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最優(yōu)條件如下：25 μL體系：2×One Step RT-PCR buffer 12.5 μL，TaKaRa ExTaqHS 0.5 μL，Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μL，上、下游引物1 μL(10 μmol/L)，熒光探針1 μL(10 μmol/L)，BVDV RNA模板5 μL，用去離子水補(bǔ)足25 μL。

1.2.3 RT-PCR最優(yōu)反應(yīng)程序 熒光定量檢測在eppendorf realplex上進(jìn)行，其反應(yīng)程序為：42℃ 5 min；95℃ 10 s，95℃ 5 s，61.3℃ 30 s，反應(yīng)進(jìn)行40個循環(huán)，于61.3℃進(jìn)行熒光信號采集。

1.2.4 特異性試驗 將PCV2、PRV、TGEV、PEDV、PRRSV、BVDV、CSFV等病毒核酸應(yīng)用已優(yōu)化的方法進(jìn)行相應(yīng)的特異性試驗。

1.2.5 重復(fù)性試驗 根據(jù)已優(yōu)化的反應(yīng)條件，對同一樣品提取BVDV RNA模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測。

1.2.6 敏感性試驗 將BVDV種毒(105.5TCID50/mL)進(jìn)行10倍比例的稀釋，每個稀釋度分別提取RNA核酸進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測。

1.2.7 方法的初步應(yīng)用

1.2.7.1 疫苗及血清的檢測 用建立的BVDV熒光定量RT-PCR方法檢測豬瘟弱毒細(xì)胞苗15批，以及新生牛血清樣品6批(3批國產(chǎn)，3批進(jìn)口)，Ct值在40以內(nèi)的判為陽性結(jié)果，無Ct值判為陰性。

1.2.7.2 豬瘟疫苗成品與BVDV種毒混合檢測 將豬瘟弱毒細(xì)胞苗成品與BVDV種毒按照不同比例混合，共計10個樣(表2)。分別提取每個樣品的RNA，用建立的方法檢測，結(jié)果判定與1.2.7.1一致。

表2 豬瘟疫苗成品與BVDV不同比例的樣品

“*”中的BVDV含量是指用DMEM將BVDV進(jìn)行10倍倍比稀釋后，10 μL中含有BVDV的量，“-”表示未添加該項目。

“*”The content of BVDV in 10 μL after BVDV was diluted by DMEM,“-”means not add.

2 結(jié)果

2.1 特異性檢測結(jié)果

以PCV2、PRV、TGEV、PEDV、PRRSV的核酸為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR，結(jié)果僅BVDV 核酸有熒光曲線擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。對購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的CSFV種毒，自繁第F481代次種毒進(jìn)行BVDV熒光定量RT-PCR檢測，該樣品重復(fù)提取4個樣品進(jìn)行，結(jié)果表明提供的CSFV種毒脾毒的核酸BVDV檢測結(jié)果為陰性(圖2)。綜上所述，BVDV熒光定量RT-PCR檢測方法對PCV2、PRV、PRRSV、TGEV、PEDV、CSFV的檢測結(jié)果均為陰性。

2.2 重復(fù)性試驗檢測結(jié)果

同一模板重復(fù)進(jìn)行8次熒光定量RT-PCR反應(yīng)，結(jié)果表明所有的樣品的Ct值介于25.94～26.54之間，最大Ct值相差0.6，表明檢測樣品結(jié)果的重復(fù)性較好，其熒光擴(kuò)增曲線分別見圖3、表3。

表3 重復(fù)性試驗樣品檢測Ct值

2.3 敏感性試驗結(jié)果

將BVDV種毒進(jìn)行10倍稀釋提取核酸進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，其最低檢測量達(dá)到10-2.5TCID50/mL(0.0 032 TCID50/mL)，不同稀釋度熒光定量曲線擴(kuò)增圖及檢測Ct值分別見圖4和表4。

2.4 方法的初步應(yīng)用

2.4.1 疫苗及血清的檢測 用建立的BVDV熒光定量RT-PCR方法檢測豬瘟弱毒疫苗15批，以及牛血清樣品6份，結(jié)果顯示只有1批國產(chǎn)血清檢測結(jié)果呈陽性(表5)。

2.4.2 分別提取每個混合樣品的RNA，利用建立的BVDV熒光定量RT-PCR方法檢測(表6)。

圖1 BVDV熒光定量RT-PCR的特異性檢測

圖2 CSFV熒光定量RT-PCR的特異性

圖3 BVDV熒光定量RT-PCR的重復(fù)性檢測

表4 敏感性試驗不同稀釋度檢測結(jié)果

圖4 BVDV熒光定量RT-PCR反應(yīng)敏感性試驗

表5 新生牛血清及豬瘟弱毒疫苗中BVDV檢測結(jié)果

注：“-”代表樣品檢測無Ct值；“+”代表樣品檢測的Ct值<40。

Note:“-”means no Ct value detected；“+”means Ct value<40.

表6 不同比例混合樣品的BVDV檢測結(jié)果

3 討論

通過NCBI GenBank中公開的BVDV序列設(shè)計的一對引物及一條特異性探針，建立了一步法BVDVTaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法。通過對該方法進(jìn)行特異性、重復(fù)性以及敏感性試驗，結(jié)果表明該方法對PCV(DBN-SX07株)、PRV(Batha-K61株)、TGEV(疫苗株)、PEDV(疫苗株)、PRRSV(CH-1R株)、CSFV(C株)無特異性擴(kuò)增。病毒的最低檢測靈敏度可達(dá)到10-2.5TCID50。

BVDV常規(guī)檢測方法存在費(fèi)時、費(fèi)力或者存在非特異性反應(yīng)和敏感性低等缺點，不能為生產(chǎn)實際提供及時準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。常規(guī)的RT-PCR檢測方法的敏感性不如熒光定量RT-PCR[15]。實時熒光定量PCR方法分為兩種，一種是非特異性熒光標(biāo)記SYBR Green 染料法，該方法具有適用任何DNA模板且不必設(shè)計復(fù)雜的探針，然而具有容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性和對引物特異性要求較高等缺點。另一種是特異性熒光標(biāo)記TaqMan探針法，具有對目標(biāo)序列的高特異性，引物設(shè)計相對簡單和重復(fù)性好等優(yōu)點，同時具有只適合一個特定的目標(biāo)和探針價格較高等缺點。檢測BVDV的熒光定量PCR染料法和TaqMan探針法均有報道。研究表明熒光定量RT-PCR染料法的靈敏度比常規(guī)的RT-PCR高10倍[16]，然而TaqMan探針法的靈敏度是常規(guī)RT-PCR的100倍。因此，TaqMan探針法較染料法的靈敏度高。本研究同樣采用TaqMan探針法，具有較好的敏感性，對檢測豬瘟疫苗中是否含有BVDV污染更加靈敏。

值得注意的是目前國內(nèi)豬瘟弱毒疫苗受BVDV污染仍然存在，而使用污染BVDV的豬瘟疫苗會引起仔豬 BVDV 的先天性感染，從而表現(xiàn)出與豬瘟類似的癥狀與病變。本研究建立的 BVDVTaqMan實時熒光定量RT-PCR法對豬瘟疫苗專用血清及豬瘟弱毒疫苗中是否含有BVDV進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示6批血清BVDV陽性率為16.7%，從而可以從源頭上控制BVDV污染豬瘟疫苗，15批豬瘟疫苗中未檢出BVDV。同時，本研究將豬瘟疫苗成品與BVDV種毒按照不同比例的混合，表6檢測結(jié)果具有很好的線性關(guān)系，進(jìn)一步說明了該方法的特異性、重復(fù)性及敏感性較好。因此，本文的建立BVDV快速檢測方法，為生產(chǎn)無BVDV污染的豬瘟疫苗提供了有力的保障。

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Establishment Real-time Fluorescence Quantitative RT-PCR for Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus

HUANG Jie,YUE Feng-xiong,XU Hong-jun

(ChengduTecbondBiologicalProductsCo.,Ltd,Chengdu,Sichuan,610100,China)

The aim of this study was to establish a rapid,specific and sensitiveTaqMan real-time fluorescence quantitative RT-PCR method for detection of bovine viral diarrhea virus (BVDV).A pair of primers and a probe were designed by using the Oligo 6.71 software to detect BVDV according to the nucleic acid sequence of BVDV and classical swine fever virus (CSFV) on NCBI GenBank so as to establish the method.The specificity,repeatability and sensitivity of the method were tested,the results showed that BVDV Oregon C24V strain was positive,while PCV2,PRV,TGEV,PEDV,PRRSV and CSFV test results were negative.To detect BVDV standard strains,the minimum detectable amount could reach 10-2.5TCID50.The method has good repeatability by testing the same sample repeated eight times.BVDV positive rate of the special serum of classical swine fever vaccine was 16.7%.However,BVDV positive rate of classical swine fever vaccine was not detected.Therefore,this new method provided a useful tool for free from contamination with BVDV of classical swine fever vaccine.

Bovine viral diarrhea virus; real-time fluorescent quantitative RT-PCR; Classical swine fever virus; vaccine

2016-09-19

黃 杰(1987-)，男，四川遂寧人，碩士，主要從事獸用疫苗研究。*通訊作者

S852.653

A

1007-5038(2017)05-0059-05