聚乙二醇沉淀聯(lián)用雙水相萃取法純化蛋清溶菌酶的研究

聞崇煒 趙燁清 石莉 歐陽臻

（江蘇大學藥學院，鎮(zhèn)江 212013）

聚乙二醇沉淀聯(lián)用雙水相萃取法純化蛋清溶菌酶的研究

聞崇煒 趙燁清 石莉 歐陽臻

（江蘇大學藥學院，鎮(zhèn)江 212013）

研究以聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）沉淀法聯(lián)用PEG-硫酸銨雙水相萃取體系純化蛋清溶菌酶的工藝。結果表明，向預處理的雞蛋清液中加PEG 4000至質量分數(shù)為16%時，可選擇性沉淀除去蛋清中98.1%的雜蛋白，隨后向上清液中加硫酸銨溶液至其質量分數(shù)為4.32%，可以構建PEG-硫酸銨雙水相體系，分離上相即得高純度溶菌酶。該法所得產物中96.34%為溶菌酶，其余為PEG 4000，不含有其它雜蛋白，溶菌酶總回收率達70.2%，比活為25 000 U/mg。該法簡便易行，易于放大，每毫克精制溶菌酶中僅殘留36.6 μg PEG 4000，生物安全性較高。

聚乙二醇4000；沉淀法；雙水相法；溶菌酶

溶菌酶（Lysozyme）又稱胞壁溶解酶，可以破壞微生物細胞壁的N-乙酰氨基葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4 糖苷鍵，具有良好的防腐殺菌作用。當前，溶菌酶可用于肉類、海鮮類及酒類的抗菌防腐，用于生產母乳化奶粉以提高嬰幼兒的免疫力，還可用于抗菌、抗病毒、止血及消腫止痛［1］。

我國早已成為世界上的雞蛋第一生產大國，雞蛋清資源豐富。雞蛋清中含有占蛋白總量0.3%-0.4%的溶菌酶，是生產商品化溶菌酶的最常用原料，常用工業(yè)化生產工藝有直接結晶法和離子交換法［2］。已有多個課題組研究了鹽析法與離子交換法的優(yōu)化以改進溶菌酶的制備工藝［3-5］。此外，還有課題組研究了用超濾法制備溶菌酶的工藝［6，7］。為進一步開發(fā)更簡便易行的工藝，本研究以聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）沉淀法結合PEG-硫酸銨雙水相萃取技術（Aqueous two-phase extraction，ATPE）純化制備蛋清溶菌酶的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雞蛋購自江蘇大學愷源旅游超市；PEG 4000購自國藥集團化學試劑有限公司；丙烯酰胺、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、甘氨酸、過硫酸銨、硫酸銨、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、丙酮均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）購自AMRESCO公司；巰基乙醇購自Bio Basic Inc公司；溶菌酶標準品（15 000 U/mg）、溶壁微球菌均購自上海生工生物工程有限公司，蛋白分子量標準品購自TAKARA公司，含有14.3、20.1、29.0、44.3、66.4和97.2 kD 6條條帶。

1.2 方法

1.2.1 蛋清液與PEG貯存液準備 鮮雞蛋洗凈并分離足量雞蛋清，加兩倍體積ddH2O稀釋，低速攪拌均勻，隨后在攪拌中調節(jié)至pH5.0左右即得蛋清液，置于-20℃保存?zhèn)溆谩＞芊Q取適量PEG 4000，加入等質量ddH2O，攪拌至PEG 4000充分溶解，即得質量分數(shù)50%的PEG貯存液，貯存液至少靜置1 d后再用于PEG沉淀。

1.2.2 PEG沉淀法 取凍存蛋清液，化凍后以9 600×g離心20 min，稱取適量澄清的上清液，100 r/min低速攪拌下滴加PEG 4000貯存液至預設質量分數(shù)，靜置2 h，取適量樣品以9 600×g離心20 min，分別收集上清與沉淀備用及后續(xù)檢測。

1.2.3 PEG-硫酸銨雙水相萃取法 稱取按1.2. 2所述流程以16%的PEG4000處理所得上清多份，按5%、10%、15%、20%、25%、30%的質量比分別加入所需飽和硫酸銨溶液，于漩渦混勻器上充分混合后以9 600×g離心20 min分相，分別取上相和下相待后續(xù)檢測。按下式計算相比（R）、萃取率（K）：

其中，CT、CB分別為上相與下相溶菌酶濃度（mg/ mL），VT、VB分別為萃取后上相與下相溶液體積（mL）。

1.2.4 溶菌酶提取工藝 稱取適量澄清蛋清液，攪拌中加PEG 4000貯存液至終質量分數(shù)為16%，靜置2 h，9 600×g離心20 min，收集得上清；按上清質量比的1/10加入飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置1 h，9 600×g離心20 min，收集上相，透析，冷凍干燥即得溶菌酶。

1.2.5 蛋白質電泳（SDS-PAGE） 樣品用適量ddH2O溶解，取少量加等體積2×上樣緩沖液，沸水浴處理15 min得電泳樣品。SDS-PAGE按Laemmli法［8］所述操作，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，70 V進行電泳，待溴酚藍到達分離膠底部后終止電泳，剝下凝膠，考馬斯亮藍R250染色。

1.2.6 HPLC法測定溶菌酶純度 采用安捷倫LC 1200液相色譜儀，色譜柱為Eclipse Plus C18（100 mm×4.6 mm ID），流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：含0.1%甲酸的乙腈溶液，溶菌酶樣品及標準品用B液溶解，0.45 μm濾膜過濾后進樣。流速：1.0 mL/min（0-10 min B液 10%；10-25 min B液從10%-60%；25 V 35 min B液 60%），柱溫為30℃，進樣量為20 μL，樣品濃度為10 mg/mL，檢測波長280 nm。

1.2.7 紅外法測定溶菌酶吸收峰 采用美國Nicolet公司Avatar-370型傅立葉變換紅外光譜儀，將凍干樣品（約2 mg）與KBr（200 mg）充分混勻，壓片，置于紅外光譜儀的變溫附件中于4 000-400 cm-1范圍內掃描。

1.2.8 濁度法測定溶菌酶生物活性 稱取適量溶菌酶，以0.05 mol/L（pH6.2）的PBS緩沖液溶解后稀釋至50 μg/mL。取50 μL 溶菌酶溶液，加入酶標板中，再加入200 μL以0.05 mol/L（pH6.2）的PBS緩沖液稀釋至0.3 mg/mL的溶壁微球菌懸液，混勻，置于酶標儀中以450 nm每隔30 s測定濁度的降低值，歷時5 min。以50 μL PBS緩沖液與200 μL菌懸液的混合液為空白對照。以25℃下450 nm處每分鐘使吸光度值降低0.001為1個酶活力單位（U），比活單位為U/mg。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 SDS-PAGE凝膠數(shù)據(jù)按以下流程處理：以Quantity One 軟件（美國BIO-RAD公司）定量各條帶灰度值，按如下公式計算各樣品中溶菌酶沉淀率（PR）及純度（PU）［9］。

其中，PGLYZ代表沉淀中溶菌酶灰度值，EGLYZ代表蛋清中溶菌酶灰度值，NP與NE分別代表沉淀及蛋清稀釋倍數(shù)，SGLYZ代表樣品中溶菌酶灰度值，SGALL代表沉淀中所有蛋白質灰度值。

HPLC數(shù)據(jù)按峰面積法進行定量。

2 結果

2.1 PEG用量對溶菌酶回收率及純度的影響

對1.2.2所述獲得的上清進行溶菌酶回收率及純度的分析。結果如下：（1）上清中溶菌酶回收率隨PEG用量的遞增而逐步遞減。當PEG 4000質量分數(shù)從2%遞增到30%時，上清中溶菌酶回收率從95.4%逐步遞減至42.4%；（2）上清中溶菌酶純度隨PEG用量的遞增而逐步遞增。當PEG 4000質量分數(shù)從2%遞增到30%時，上清中溶菌酶純度從12.6%逐步遞增至100%（圖1）。

圖1 PEG4000用量對溶菌酶回收率及純度的影響

2.2 硫酸銨用量對雙水相體系及溶菌酶萃取的影響

按1.2.3所述加入飽和硫酸銨溶液至最終質量分數(shù)分別為2.16%、4.32%、6.48%、8.64%、10.8%、 12.96%，考察PEG-硫酸銨雙水相體系的形成，分離上下相后精密稱重及計算體積，由此計算相應相比（R）及溶菌酶的萃取率（K）。結果如下：（1）硫酸銨質量分數(shù)越高，雙水相體系兩相間差異越大，分相越快越清晰，同時上相體積越少，下相體積越大，即相比越低；（2）硫酸銨質量分數(shù)高于10.8%時，分相后在上下相間有蛋白質析出，會造成溶菌酶顯著損失；（3）硫酸銨質量分數(shù)為4.32%時，雙水相萃取效果最好，此時上下相分界清晰，上相易于分離，溶菌酶萃取率可達95.67%（表1）。

表1 硫酸銨用量對相比及萃取率的影響

2.3 溶菌酶的小試制備及質量分析

根據(jù)上述PEG 4000及硫酸銨的優(yōu)化用量，處理300 mL蛋清液，共計得到樣品245.4 mg。SDSPAGE分析（圖2）表明樣品為單一條帶，遷移率與溶菌酶標準品完全一致。HPLC分析（圖3）表明樣品中主峰保留時間為17 min，也與溶菌酶標準品保留時間一致。因此，本工藝所得樣品為高純度溶菌酶，總回收率為70.2%。濁度法測定所得溶菌酶樣品的比活為25 000 U/mg。此外，HPLC分析表明，次峰保留時間為30.9 min，為PEG峰，比例為3.66%。PEG 4000具有良好的生物安全性，不影響溶菌酶在食品及醫(yī)藥工業(yè)的應用。

目前認為1 600-1 700 cm-1之間是由蛋白多肽骨架的C=O伸縮振動引起的酰胺Ⅰ帶的特征吸收峰，是蛋白質二級結構變化的敏感區(qū)域。圖4為溶菌酶樣品的紅外吸收圖譜，其中1 631、1 552、1 402 cm-1處的吸收峰與溶菌酶標準品的吸收峰吻合，此外1 461、1 298和1 137 cm-1處的吸收峰與PEG的吸收峰吻合，表明樣品中既含有溶菌酶，同時尚有少量PEG。

3 討論

PEG是含有多羥基結構的長鏈高分子聚合物，既可以纏繞沉淀蛋白質分子，同時還可使蛋白質分子脫水而形成沉淀。PEG沉淀法具有操作簡便、易于放大、條件溫和等優(yōu)點，目前已被用于棉鈴蟲幼蟲中腸及脂肪體微粒體蛋白、豬胰蛋白酶、牛輪狀病毒及重組抗體的純化［10-16］。雙水相萃取技術也是一種高效而溫和、易于放大操作的生物分離技術。本課題組在前期研究中已發(fā)現(xiàn)僅用PEG沉淀法制備蛋清溶菌酶，不僅需要較多PEG，而且溶菌酶得率較低，因此研究了PEG沉淀聯(lián)用雙水相萃取法以純化溶菌酶的工藝。

圖2 溶菌酶樣品的SDS-PAGE結果

圖3 溶菌酶樣品的HPLC結果

圖4 溶菌酶樣品的紅外掃描結果

PEG沉淀結果表明，PEG 4000優(yōu)先選擇性沉淀蛋清中卵白蛋白及卵轉鐵蛋白為主的雜蛋白，溶菌酶保留在上清中，使其得到純化，但是PEG 4000用量過高則會導致較多溶菌酶沉淀而降低上清中溶菌酶的回收率。進一步分析表明，當PEG 4000質量分數(shù)為16%時，可以沉淀除去98.1%的雜蛋白，上清中仍可回收到74.7%的溶菌酶，純度可達58.2%；當PEG 4000質量分數(shù)為28%甚至更高時，雖然可以沉淀除去幾乎所有其它雜蛋白，但溶菌酶回收率僅有42%左右。因此，為了兼顧溶菌酶回收率及純度，PEG 4000沉淀時最終質量分數(shù)宜為16%。同時所得上清宜再加入硫酸銨至最終質量分數(shù)為4.32%以構建雙水相萃取體系，此時上相中可以得到電泳純的溶菌酶，且具有較高的生物活性。該工藝中PEG一物兩用，首先作為雜蛋白的沉淀劑，隨后作為雙水相體系的成相物，操作極其簡便。同時由于無毒及良好的生物相容性，PEG目前已被FDA批準為體內注射藥用聚合物，因此，上述樣品中雖有少量PEG 4000殘留（每毫克精制溶菌酶中殘留量為36.6 μg），但基本不影響溶菌酶在食品及藥品等領域的應用。

4 結論

本研究建立兩步法純化蛋清溶菌酶的工藝：首先向蛋清液中加PEG 4000至其質量分數(shù)為16%，隨后向上清液中加質量比為10%的飽和硫酸銨溶液，分離所得PEG-硫酸銨雙水相體系的上相，即為高純度溶菌酶，總回收率為70.2%，比活為25 000 U/mg。該法簡便易行，易于放大，無需貴重復雜設備，所得溶菌酶具有較高的生物安全性。

［1］ 趙龍飛, 徐亞軍. 雞蛋清中溶菌酶的應用性研究［J］. 食品工業(yè), 2006, （3）：19-20.

［2］ 趙法利, 劉靜波, 劉瑜, 等. 雞蛋中功能成分的研究［J］. 食品科學, 2006, 27（12）：798-802.

［3］ 趙哲勛. 從雞蛋殼中提取分離溶菌酶［J］. 食品科學, 1993, （1）：45-46.

［4］ 張文會, 王艷輝, 馬潤宇. 離子交換法提取雞蛋清溶菌酶［J］.食品工業(yè)科技, 2003, 24（6）：57-59.

［5］ 余海芬, 馬美湖, 劉巖. 陽離子交換法提取蛋清溶菌酶的研究［J］. 中國家禽, 2008, 30（24）：22-25.

［6］ Wan YH, Lu JR, Cui ZF. Separation of lysozyme from chicken egg white using ultrafiltration［J］. Separation and Purification Technology, 2006, 48（2）：133-142.

［7］ Datta D, Bhattacharjee S, Nath A, et al. Separation of ovalbumin from chicken egg white using two-stage ultrafiltration technique［J］. Separation and PurificationTechnology, 2009, 66（2）：353-361.

［8］ Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］. Nature, 1970, 227：680-685.

［9］ 聞崇煒, 毛春友, 胡萍萍, 等. Tricine 蛋白質電泳定量檢測溶菌酶方法的研究［J］. 江蘇農業(yè)科學, 2012, 40（5）：290-292.

［10］ 鄭明奇, 張文吉, 邱星輝, 等. 聚乙二醇8000對棉鈴蟲微粒體蛋白沉淀作用的研究［J］. 農藥學學報, 2005, 7（1）：81-84.

［11］ 余英武, 趙金梅, 肖青虎, 等. 聚乙二醇沉淀豬胰蛋白酶的研究［J］. 西華大學學報, 2011, 30（5）：96-99.

［12］ Fontes LVQ, Campos GS, Beck PA, et al. Precipitation of bovine rotavirus by polyethylen glycol（PEG）and its application to produce polyclonal and monoclonal antibodies［J］. Journal of Virological Methods, 2005, 123（2）：147-153.

［13］ Giese G, Myrold A, Gorrell J, et al. Purification of antibodies by precipitating impurities using Polyethylene Glycol to enable a two chromatography step process［J］. Journal of Chromatography B, 2013, 938：14-21.

［14］ Sommer R, Satzer P, Tscheliessnig A, et al. Combined polyethylene glycol and CaCl2precipitation for the capture and purification of recombinant antibodies［J］. Process Biochemistry, 2014, 49（11）：2001-2009.

［15］ Hu XT, Liu CM, Jin ZY, et al. Fractionation of dextrin by gradient polyethylene glycol precipitation［J］. Journal of Chromatography A, 2016, 1434：81-90.

［16］ Hammerschmidt N, Hobiger S, Jungbauer A. Continuous polyethylene glycol precipitation of recombinant antibodies：Sequential precipitation and resolubilization［J］. Process Biochemistry, 2016, 51（2）：325-332.

（責任編輯 李楠）

Purification of Lysozyme from Egg White by Combination of Polyethylene Glycol Precipitation and Aqueous Two-phase Extraction

WEN Chong-wei ZHAO Ye-qing SHI Li OUYANG Zhen
（School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

This work aims to establish a new technology of purifying lysozyme from egg white based on the combination of polyethylene glycol（PEG）precipitation and aqueous two-phase extraction. The results showed that 98.1% of non-lysozyme proteins were removed by the precipitation when PEG 4000 was added into pretreated egg white until its mass fraction reached 16%. Then，the supernatant of PEG precipitation was collected and mixed with saturated（NH4）2SO4solution until the mass fraction of this salt reached 4.32%. Therefore，the aqueous two-phase system of PEG/（NH4）2SO4was established and most of lysozyme could be transferred into the top phase. It was found that 96.34% of the freeze-dried top phase was lysozyme，and the rest was PEG 4000，no any other proteins existed. The recovery rate and the specific activity of lysozyme were 70.2% and 25 000 U/mg，respectively. In conclusion，this purification technology was simple，accurate，safe and reliable，and could be used for large-scale production of lysozyme.

polyethylene glycol 4000；precipitation；aqueous two-phase extraction；lysozyme

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.013

2016-12-19

國家自然科學基金項目（81573529），江蘇大學高級人才啟動基金（1281370001），江蘇省普通高校研究生實踐創(chuàng)新計劃項目（SJLX15_0512）

聞崇煒，男，博士，副教授，研究方向：生物活性蛋白質分離及功能；E-mail：wenchw@ujs.edu.cn