植物防御素在抗植物病害方面的應(yīng)用

何玲++楊素云++劉媛++曹旭++鐘婧++竺錫武++吳娟

摘要 植物防御素是一類堿性、富含半胱氨酸、具有抗菌活性的低分子量多肽。不同植物防御素抗菌活性差異較大，但高級(jí)結(jié)構(gòu)相似，都是1個(gè)α-螺旋和3個(gè)反向平行的β片層結(jié)構(gòu)。植物防御素具有抑制酶活、抑菌、抑制癌細(xì)胞生長等功能，其作用機(jī)理主要是與真菌細(xì)胞膜上鞘脂等復(fù)雜脂類相互作用。植物防御素具有抗菌譜廣泛和高效性的特點(diǎn)，將在植物抗病基因工程和作物品種改良中發(fā)揮重要作用，并有望開發(fā)成為新型的抗菌劑以減少農(nóng)藥的使用。本文綜述了植物防御素的結(jié)構(gòu)、功能、作用機(jī)理以及在植物抗病蟲害基因工程上的應(yīng)用研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 植物防御素；抑菌作用；基因工程；病害

中圖分類號(hào) Q946 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）07-0147-03

Application of Plant Defensin on Plant Disease Resistance

HE Ling 1 YANG Su-yun 1 LIU Yuan 1 CAO Xu 1 ZHONG Jing 1 ZHU Xi-wu 1，2 WU Juan 1，2 *

（1 College of Agriculture and Biotechnology，Hunan University of Humanities，Science and Technology，Loudi Hunan 417000；

2 Collaborative Innovation Center for Farmland Weeds Control ）

Abstract Plant defensin is one kind of short peptides with low molecular weight，basic，cysteine-rich and antimicrobial activity.Antimicrobial activity of different plant defensin have large difference，but the higher structures are similar，which have one α-helix and three antiparallel β-sheets.Plant defensins can inhibit enzyme activity，antifungal activity and cancer cell proliferation.The mechanism of plant defensins is that it binds the complex lipids those from the outside of fungal plasma membrane.Because of broad anti-microbes activity and high efficiency，it will play an important role in plant genetic engineering of disease resistance and varieties improvement of plant，even be used as novel germicides in order to reduce the use of pesticides.The structural characteristics，biological functions，mechanism，progress in plant genetic engineering of plant defensins were reviewed in this paper.

Key words plant defensin；antifungal activity；genetic engineering；disease

植物像動(dòng)物一樣也有一個(gè)內(nèi)在的防御系統(tǒng)，在外部病原菌侵染下，植物體內(nèi)精巧的免疫防御系統(tǒng)會(huì)被誘導(dǎo)激活。這種反應(yīng)一般稱為植物的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性，對(duì)一系列不相關(guān)的病原菌有廣譜抗性[1]。植物體內(nèi)會(huì)合成大量的抗性化合物，一些抗菌蛋白質(zhì)也會(huì)被誘導(dǎo)產(chǎn)生，以阻止病原菌進(jìn)一步繁殖擴(kuò)展[2]。植物防御素正是這樣一類具有抗菌活性的低分子量短肽。

防御素最早發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物多形核中性粒細(xì)胞中，后來從昆蟲中也提取到了昆蟲防御素，在分子量、電荷及對(duì)革蘭氏陽性菌的抗性上，與哺乳動(dòng)物防御素有很大的相似性[3]。1990 年，Mendez 等發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)植物防御素，其氨基酸序列、保守氨基酸位點(diǎn)和三維結(jié)構(gòu)與昆蟲防御素相似[4]。植物防御素是一類分子量小（約5 kD，由45～54 個(gè)氨基酸組成）、堿性、富含半胱胺酸、具有抗菌活性和復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的陽離子多肽。

1 植物防御素的結(jié)構(gòu)

防御素一般是分泌型蛋白，其編碼區(qū)域主要可分為2個(gè)部分。一個(gè)是信號(hào)肽區(qū)域，主要由疏水性氨基酸組成，引導(dǎo)防御素前體蛋白與膜脂結(jié)合通過膜分泌到胞外空間；另一個(gè)是成熟肽區(qū)域，前體蛋白到達(dá)特定部位后，切除信號(hào)肽成為成熟蛋白質(zhì)發(fā)揮作用[5]。目前，已鑒定出數(shù)百種植物防御素，不同植物防御素抗菌活性具有較大差異。植物防御素通常由50個(gè)左右氨基酸殘基組成，分子量約為5.0 kD，其中除8個(gè)保守半胱氨酸殘基外，其余均非常不保守。同源性較低，但高級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似。如從蘿卜種子中分離的防御素（Rs-AFP1），其高級(jí)結(jié)構(gòu)通過核磁共振闡明由1個(gè)α-螺旋和3個(gè)反向平行的β-折疊片層組成一個(gè)緊密的球形結(jié)構(gòu)，位于α-螺旋中的第21位、25位Cys與位于第3個(gè)β-折疊片層中的第45位、47位Cys形成了2對(duì)二硫鍵，8個(gè)保守半胱氨酸殘基形成了4對(duì)二硫鍵對(duì)維持該結(jié)構(gòu)發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此命名為Cys穩(wěn)定的α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)，簡稱CSαβ（Cysteine stab-ilized α β motif）[6]。豌豆種子防御素PsD1[7]和綠豆防御素VrD1[8]的基本結(jié)構(gòu)也類似。

2 植物防御素的功能

2.1 抑制酶的活性

植物防御素SIα1、SIα2和SIα3均對(duì)昆蟲消化酶α-淀粉酶有特異性抑制作用，但是對(duì)來自其他生物的α-淀粉酶無抑制活性或只有很弱的抑制活性[6]。另外，來自綠豆的防御素VrD1在昆蟲飼料中含量達(dá)0.2%時(shí)就能使昆蟲致死[9]。因此，植物防御素很有可能通過抑制昆蟲對(duì)淀粉的消化來殺蟲，在植物抗蟲方面發(fā)揮重要作用。來自殺蟲植物豬腸豆（Cas-sia fistula Linn.）的一種植物防御素5459有胰蛋白酶抑制活性，而另外一種多肽5144則無該活性，二者只有幾個(gè)氨基酸的區(qū)別[10]。

2.2 抑菌作用

大部分植物防御素都具有抑制真菌生長的功能，其IC50取決于真菌種類和植物防御素來源。H.Saitoh等[11]用馬鈴薯病毒載體PVX在本生煙中表達(dá)芥末的防御素蛋白WT1，再從病毒感染的葉片中提取，并用親和層析的方法純化蛋白，測得WT1抑制稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的IC50為5 μg/mL，抑制灰霉病菌（Botrytis cinerea）的IC50為20 μg/mL。李 平等[12]研究報(bào)道苜蓿種子防御素基因alfAFP在酵母中有效分泌表達(dá)，加alfAFP酵母表達(dá)產(chǎn)物22.0 μg 時(shí)對(duì)紋枯病有較強(qiáng)的抑菌圈，加入量為21.98和22.00 μg 時(shí)對(duì)稻瘟病和白葉枯病有一定的抑制作用。

植物防御素的抗微生物活性主要表現(xiàn)在抗真菌上，也能抑制部分細(xì)菌，但作用偏弱。如H.Saitoh等[11]報(bào)道純化的防御素WT1-His6在濃度為10 μg/mL時(shí)對(duì)病原真菌稻瘟病菌和灰霉病菌的菌絲生長有明顯的抑制作用，但是對(duì)病原細(xì)菌假單胞菌沒有明顯抑制作用；濃度達(dá)到20 μg/mL時(shí)，才能觀察到微弱的生長抑制作用。

2.3 抑制癌細(xì)胞生長

植物防御素對(duì)特定種類人腫瘤細(xì)胞的抑制活性已有報(bào)道，如來自田豆的植物防御素Sesquin能夠抑制白血病的L1210和M1細(xì)胞系，抑制率分別達(dá)到35%、80%；對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞系抑制率約80%[13]。

3 作用機(jī)理

與人、昆蟲的防御素不同，植物防御素在人工磷脂膜上不能形成離子通道，也不改變磷脂雙分子層的電荷特性。說明其不直接作用于真菌質(zhì)膜磷脂[14]。因?yàn)檎婢?xì)胞膜上磷脂分布于內(nèi)側(cè)，鞘脂、麥角甾醇等復(fù)雜脂類分布在外側(cè)，所以植物防御素更可能是作用于膜上鞘脂等復(fù)雜脂類，然后誘導(dǎo)一系列快速反應(yīng)，如Ca2+ 吸收、K+ 流出、改變膜結(jié)構(gòu)及通透性等[15]。大麗菊植物防御素（DmAMP1）與真菌質(zhì)膜中甘露糖苷二肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺M（IP）2C相互作用，來自胡蘿卜種子的植物防御素（RsAFP2）則是結(jié)合菌類質(zhì)膜中葡糖神經(jīng)酰胺（GlcCer）[16]。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，RsAFP2只作用于真菌類的神經(jīng)酰胺，并不作用于人和植物，因?yàn)槠渖窠?jīng)酰胺結(jié)構(gòu)不同，如神經(jīng)鞘胺脂底部分枝的9-甲基基團(tuán)、不飽和程度和脂肪酸鏈長度。這些結(jié)構(gòu)特征決定著其與防御素的作用特點(diǎn)[16]。

4 在植物抗病蟲害基因工程中的應(yīng)用

植物防御素所表現(xiàn)出來的生物學(xué)活性如抗微生物、殺蟲活性等，使其成為植物抗病蟲害基因工程的優(yōu)良候選材料。禾谷類是病蟲害高發(fā)作物，防御素基因工程在禾谷類作物的病蟲害抗性研究中起到了重要作用。Kanzaki等[17]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將防御素WT1的基因?qū)胨荆?2個(gè)T2代純合株系對(duì)稻瘟病菌表現(xiàn)出不同程度的抗性，由其中2個(gè)高抗株系得到的T3代植株病斑比對(duì)照株縮小了約1/2。

有些植物防御素不僅對(duì)1種真菌起作用，而是對(duì)多種植物真菌病原體均有抑制活性，是其在植物抗病蟲害中的又一大優(yōu)勢。真菌病害是瓜類危害最嚴(yán)重的病害，在西非廣泛種植的一種高度耐干旱甜瓜Egusi的產(chǎn)量受枯萎病和黑斑病的影響極大。2010年Ntui等[18]通過根瘤農(nóng)桿菌EHA101介導(dǎo)，獲得轉(zhuǎn)防御素WT1基因甜瓜。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了RT-PCR、northern和western blot分析，目的基因在甜瓜植株中有效表達(dá)。離體葉片接種枯萎病菌或早疫病菌后，引起的病征比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ昭舆t3 d出現(xiàn)，且壞死病斑較小，總面積僅有非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?/3。整株植株的體外感染試驗(yàn)結(jié)果類似，對(duì)于早疫病菌引起的黑斑病和枯萎病菌引起的枯萎病，轉(zhuǎn)基因植株較非轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更高的抗性。值得注意的是，這些轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出對(duì)枯萎病和黑斑病的抗性是非特異性的，意味著這種抗性能夠長久的保持，而且在田間環(huán)境下也是有效的。這些轉(zhuǎn)基因甜瓜可能對(duì)于其他真菌病害也有抗性，如Kanzaki等[17]報(bào)道表達(dá)防御素WT1的轉(zhuǎn)基因水稻能抑制稻瘟病生長，Khan等[19]報(bào)道表達(dá)防御素WT1的轉(zhuǎn)基因土豆對(duì)灰霉病菌表現(xiàn)很高的抗性。因此，推測防御素WT1能抗許多真菌病原菌，甚至包括一些細(xì)菌病原菌。

抗病基因抗菌譜不夠廣、病菌對(duì)其敏感度易下降或田間抗病效果不理想等缺點(diǎn)限制了植物抗病基因工程的發(fā)展。植物防御素是對(duì)大部分動(dòng)植物真菌病害和細(xì)菌病害都有效的一類抗菌蛋白，其基因可作為優(yōu)良抗病基因轉(zhuǎn)入植物基因組，且其本身對(duì)于人和動(dòng)物食用安全，如防御素WT1基因來自芥末（一種日本料理的主要調(diào)味料）。目前已有多種防御素基因?qū)胫仓曛杏糜谠黾又仓昕剐?，并檢測到已表達(dá)的植物防御素蛋白及其抗菌活性。如把來自紫花苜蓿防御素的基因MsDef1轉(zhuǎn)入番茄基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株對(duì)枯萎病有較好抗性[20]。Terras等[21]將一種蘿卜種子防御素Rs2AFP2的基因轉(zhuǎn)入煙草，其表達(dá)量可達(dá)葉片總蛋白的0.2%，明顯增強(qiáng)了煙草植株對(duì)小葉病原菌煙草赤星病菌（Alternaria longipes）的抗性，之后有研究人員將其應(yīng)用于番茄，獲得類似結(jié)果[22]。

但轉(zhuǎn)植物防御素基因的植物一般不會(huì)對(duì)某種病原菌產(chǎn)生完全抗性，要想獲得完全的抗性或者更強(qiáng)的抗性，可以將其他抗性基因一起轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞[18，23]。植物防御素與其他抗菌化合物協(xié)同作用，有助于增強(qiáng)植株抗性，甚至還可能增強(qiáng)對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)能力[6]。Chen等[24]將煙草的β-1，3-葡聚糖酶、苜蓿防御素alfAFP及雙價(jià)基因轉(zhuǎn)入番茄，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的抗性增強(qiáng)，且雙價(jià)基因轉(zhuǎn)化株抗性更高。

5 結(jié)語

總之，植物防御素以其廣泛的抗菌譜和高效性的特點(diǎn)，有望在研制新型綠色生態(tài)抗菌劑和培育新品種方面發(fā)揮重要作用，建立無污染的農(nóng)業(yè)生態(tài)生產(chǎn)模式。但是植物防御素的胞內(nèi)受體以及外界條件對(duì)植物防御素基因表達(dá)的誘導(dǎo)機(jī)理尚不明確，植物防御素基因轉(zhuǎn)入植物后基因表達(dá)的沉默問題也需要進(jìn)一步研究。

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