劉鴻艷，張耀光，張松林，沈志強(qiáng)，馬永彪

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；3.山東省濱州海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)站，山東濱州 256600)

無(wú)乳鏈球菌LIP蛋白的截短表達(dá)及免疫保護(hù)性研究

劉鴻艷1,3，張耀光1，張松林2，沈志強(qiáng)2，馬永彪2

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；3.山東省濱州海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)站，山東濱州 256600)

為評(píng)價(jià)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)BX2012株脂蛋白(lipoprotein)的免疫原性及其對(duì)奧利亞羅非魚(yú)(Oreochromisaureus)和大菱鲆(Scophthalmusmaximus)的保護(hù)效果，以無(wú)乳鏈球菌脂蛋白基因序列(GenBank序列號(hào)：CP000114.1，SAK_0321)的B細(xì)胞線性抗原表位區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建重組表達(dá)載體，將截短表達(dá)的脂蛋白制備成亞單位疫苗，同時(shí)制備滅活疫苗進(jìn)行免疫比對(duì)。結(jié)果顯示：重組表達(dá)載體pET-32a-LIP342在BL21(DE3)中獲得了良好的可溶性表達(dá)，分子質(zhì)量約為30 kDa，純化使LIP342純度由41.75%提至87.23%；Western blotting分析顯示，LIP342可被兔抗無(wú)乳鏈球菌高免血清特異性識(shí)別；LIP342在目前已知不同種屬來(lái)源或不同血清型的無(wú)乳鏈球菌分離株中同源性為90.35%～100%，在羅非魚(yú)源分離株中同源性為100%；無(wú)乳鏈球菌LIP342蛋白和滅活疫苗均可顯著提升奧利亞羅非魚(yú)和大菱鲆血清抗體水平，而LIP342誘導(dǎo)的血清抗體水平均顯著高于滅活疫苗；經(jīng)0.1 mL 1×109cfu/mL的無(wú)乳鏈球菌攻毒后，LIP342蛋白和滅活疫苗對(duì)供試魚(yú)的累積存活率均顯著高于PBS對(duì)照組。結(jié)果表明，高度保守的LIP342具有較好的免疫原性，可作為無(wú)乳鏈球菌亞單位疫苗候選因子。

無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)；脂蛋白；截短表達(dá)；免疫保護(hù)；奧利亞羅非魚(yú)(Oreochromisaureus)；大菱鲆(Scophthalmusmaximus)

作為牛乳腺炎重要病原菌[1]和新生兒首要致病、致死菌[2]的無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)，近年來(lái)卻引起了多種魚(yú)類的爆發(fā)性感染和死亡，全球每年因無(wú)乳鏈球菌病造成的漁業(yè)損失均高達(dá)100億美元[3]，羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)受該菌危害最為嚴(yán)重。無(wú)乳鏈球菌還存在種間交叉?zhèn)鞑ズ腿?獸-魚(yú)共患的危險(xiǎn)[4]，而且人類對(duì)魚(yú)類的消費(fèi)，可顯著增加人類受無(wú)乳鏈球菌感染的風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，安全、穩(wěn)定、高效的無(wú)乳鏈球菌疫苗已成為人類醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)共同關(guān)注的焦點(diǎn)。但無(wú)乳鏈球菌含有10種血清型，各血清型間無(wú)交叉免疫作用[6]，限制了滅活疫苗的應(yīng)用。解決此問(wèn)題的關(guān)鍵是尋求高度保守的抗原蛋白，以制備具有交叉免疫作用的疫苗。脂蛋白(Lipoprotein，LIP蛋白)是一類具有多種功能的膜蛋白，是細(xì)菌重要的毒力因子，能夠激發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[7]，可作為開(kāi)發(fā)具有交叉免疫作用疫苗的候選因子。

本研究選取無(wú)乳鏈球菌脂蛋白在大腸桿菌(Escherichiacoli)中進(jìn)行截短表達(dá)，以Western boltting分析其免疫原性，并與弗氏不完全佐劑結(jié)合，同時(shí)制備無(wú)乳鏈球菌滅活疫苗，比較研究二者對(duì)奧利亞羅非魚(yú)(Oreochromisaureus)和大菱鲆(Scophthalmusmaximus)血清抗體水平的誘導(dǎo)情況和免疫保護(hù)效果，力求同時(shí)從淡水、海水魚(yú)角度和暖水、冷水性魚(yú)角度考量LIP342蛋白的免疫效果，為羅非魚(yú)、大菱鲆的規(guī)模化健康養(yǎng)殖和經(jīng)濟(jì)效益的提升提供支撐，并為魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌亞單位疫苗的研究和應(yīng)用提供支持，對(duì)漁業(yè)規(guī)?；a(chǎn)、水產(chǎn)品質(zhì)量提升、生態(tài)環(huán)境保護(hù)和人類公共健康有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌BX2012株和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供。限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ購(gòu)自美國(guó)NEB公司，大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 血清與抗體

兔抗羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌BX2012株高免血清由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供，兔抗羅非魚(yú)免疫球蛋白多克隆抗體購(gòu)自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司，兔抗大菱鲆免疫球蛋白多克隆抗體由農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所)饋贈(zèng)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗體IgG(H+L)購(gòu)自美國(guó)Earthox公司。

1.1.3 供試魚(yú)

奧利亞羅非魚(yú)購(gòu)自山東省淡水漁業(yè)研究院的國(guó)家級(jí)羅非魚(yú)良種場(chǎng)，體重(42±8.52) g，養(yǎng)殖用水為曝氣處理的自來(lái)水，水溫(25±1) ℃；大菱鲆購(gòu)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院下?tīng)I(yíng)增殖實(shí)驗(yàn)站，體重(64±10.38) g，養(yǎng)殖用水為市售海水晶經(jīng)純化水稀釋而成的人工海水，鹽度(23±1)‰，水溫(17±1) ℃。每日按照魚(yú)體重2%投喂飼料，暫養(yǎng)1周，供試魚(yú)健康即可進(jìn)行正式試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與基因擴(kuò)增

利用生物信息學(xué)技術(shù)分析GenBank中人源無(wú)乳鏈球菌脂蛋白基因序列(GenBank 序列號(hào)：CP000114.1，SAK_0321)的B細(xì)胞線性抗原表位區(qū)，截取31-144 aa區(qū)間(共計(jì)342 bp)設(shè)計(jì)特異性引物：上游引物為5′-GGGGGATCCTCAAACGAAGTAAAAAATAGCA-3′(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物為5′-GGGGTCGACTTTATGTATATACGGCTTATTTAGC-3′(下劃線部分為SalⅠ酶切位點(diǎn))，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

利用試劑盒提取羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌BX2012株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：5×Buffer 4 μL，DNA模板2 μL，上下游引物(2 μmol/L)各5.0 μL，Taq0.2 μL，DMSO 0.6 μL，補(bǔ)加超純水至20 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s，98 ℃變性10 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物后，用美國(guó)Omega試劑盒回收目的片段。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與酶切鑒定

利用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ將目的片段定向克隆在pET-32a(+)的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化至受體菌BL21(DE3)中，然后涂種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB平板上。挑取陽(yáng)性重組菌落，經(jīng)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，抽提質(zhì)粒，以BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行酶切鑒定。鑒定正確的重組載體命名為pET-32a-LIP342，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 同源序列分析

以NCBI的BLAST在線系統(tǒng)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列相似性搜索，用綜合序列分析軟件CLC Main Workbench7.6.2進(jìn)行同源性分析，并以最大似然法(Maximum likelihood，ML)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 蛋白的表達(dá)與純化

將包含陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-32a-LIP342的BL21(DE3)菌種劃線接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種于5 mL的LB培養(yǎng)液中，180 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，按1∶100的比例接種于10 mL的LB培養(yǎng)液中，180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm=0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L；37 ℃誘導(dǎo)4 h，取1 mL菌液于4 ℃條件下12 000 r/min離心1 min，在沉淀中加入50 μL的PBS緩沖液(pH 7.4)和10 μL的5×SDS上樣緩沖液，100 ℃水浴變性10 min后進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

pET-32a-LIP342經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行大量表達(dá)，超聲波破碎后取上清，利用His-Trap FF親和層析柱，在KTApurifier 100蛋白純化系統(tǒng)上進(jìn)行純化，經(jīng)12% SDS-PAGE分析，用Quantity One 4.62軟件檢驗(yàn)純度，小量分裝后存儲(chǔ)于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Western blotting檢測(cè)

純化的LIP342蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后，用Trans-Blot SD將目的條帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PBS-T緩沖液(pH7.4)洗膜，用5%脫脂奶粉4 ℃封閉30 min，PBS-T洗滌，以兔抗羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌BX2012株高免血清(1∶500)為一抗，室溫孵育30 min，PBS-T洗滌，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000)為二抗，室溫孵育30 min，PBS-T洗滌，用DAB顯色液顯色10 min。

1.2.6 疫苗配制

將LIP342蛋白用0.01 mol/L的PBS(pH7.4)調(diào)整濃度為1 mg/mL，再與弗氏不完全佐劑(Sigma公司)等體積乳化，制成LIP342亞單位疫苗，濃度為500 μg/mL。置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。將羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌BX2012株接種于BHI肉湯培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，加入終濃度0.5%的甲醛溶液，37 ℃靜置48 h后，將濃度為109cfu/mL的菌液與等體積弗氏不完全佐劑乳化，制成滅活疫苗，濃度為5.0×108cfu/mL。PBS亦與等體積佐劑完全混勻用以對(duì)照。經(jīng)BHI固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢驗(yàn)疫苗的無(wú)菌性；每種疫苗分別注射奧利亞羅非魚(yú)和大菱鲆各10尾，每尾0.1 mL，觀察其對(duì)魚(yú)體是否存在毒副作用。通過(guò)無(wú)菌性和安全性檢驗(yàn)的疫苗即可使用。

1.2.7 免疫與攻毒

兩種魚(yú)各設(shè)LIP342免疫組和滅活疫苗免疫組，另各設(shè)2個(gè)對(duì)照組，即PBS對(duì)照組和陰性對(duì)照組。羅非魚(yú)每組50尾，大菱鲆每組40尾，以4 μL/g魚(yú)體重的劑量進(jìn)行一次性胸腔注射，即LIP342蛋白免疫劑量為2 μg/g魚(yú)體重，PBS對(duì)照組和陰性對(duì)照組分別注射同等劑量PBS。

免疫后第4周，開(kāi)始進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，奧利亞羅非魚(yú)每組攻毒40尾，大菱鲆每組攻毒30尾，LIP342免疫組、滅活疫苗免疫組和PBS對(duì)照組每尾腹腔注射0.1mL 1×109cfu/mL 的無(wú)乳鏈球菌活菌懸液，陰性對(duì)照組0.1 mL的0.5%甲醛溶液；觀察14 d，記錄各組發(fā)病與死亡情況，計(jì)算相對(duì)保護(hù)率(Relative percentage survival，RPS)，計(jì)算公式為：RPS=(1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)×100%。

1.2.8 血清抗體水平檢測(cè)

分別在奧利亞羅非魚(yú)和大菱鲆免疫的第0、7、14、21、28、35、42 d采集血清，每組每次隨機(jī)取6尾供試魚(yú)尾靜脈取血，按間接ELISA法測(cè)定血清抗體水平：LIP342蛋白包被濃度為10 ng/μL，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜，PBS-T洗滌，5%BSA 100 μL封閉0.5 h，PBS-T洗滌，加入100 μL待檢血清樣品(1∶40)，37 ℃孵育0.5 h，PBS-T洗滌，加入100 μL兔抗羅非魚(yú)免疫球蛋白多克隆抗體或兔抗大菱鲆免疫球蛋白多克隆抗體(1∶1 000)，37 ℃孵育0.5 h，PBS-T洗滌，加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)，37 ℃孵育0.5 h，PBS-T洗滌，加100 μL TMB底物顯色液顯色5 min，加50 μL 2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀OD450 nm處讀數(shù)。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

用SPSS18.0軟件對(duì)代表抗體水平的OD450 nm數(shù)值以Duncan多重比較進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著。各組抗體水平以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)形式表示。攻毒后試驗(yàn)魚(yú)的生存率采用Kaplan Meier法評(píng)估，以log rank test進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 LIP342的擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到約342 bp的條帶；構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET-32a-LIP342經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，出現(xiàn)了約342 bp的目的條帶，與預(yù)期相符(圖1)。pET-32a-LIP342測(cè)序結(jié)果已提交GenBank，序列號(hào)為KU759324。

2.2 蛋白表達(dá)、純化與Western blotting分析

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組表達(dá)載體pET-32a-LIP342在上清和包涵體均獲得了表達(dá)；對(duì)可溶性表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化后，LIP342蛋白純度由41.75%提高至87.23%；Western blotting結(jié)果顯示，LIP342蛋白能與兔抗羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌BX2012株高免血清發(fā)生特異性結(jié)合。SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組蛋白大小在30 kDa左右，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖2)。

圖1 PCR擴(kuò)增和pET-32a-LIP342酶切鑒定結(jié)果Fig.1 PCR amplification and identification of pET-32a-LIP342 M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 2-4：pET-32a-LIP342經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ酶切

圖2 LIP342蛋白表達(dá)、純化與Western blotting分析Fig.2 Expression, purification and Western blotting of LIP342 M：蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)；1，IPTG誘導(dǎo)后的pET-32a-LIP342包涵體；2，IPTG誘導(dǎo)后的pET-32a-LIP342上清； 3，未誘導(dǎo)的pET-32a-LIP342；4，IPTG誘導(dǎo)后的pET-32a；5，未誘導(dǎo)的pET-32a；6，純化前的LIP342； 7，純化后的LIP342；8；LIP342的Western blotting。

2.3 同源性分析

在GenBank中檢索到16條與LIP342具有相似性的序列，LIP342在不同種屬來(lái)源(人、牛、駱駝和羅非魚(yú))和不同血清型(Ia、III、IV、V和未知)無(wú)乳鏈球菌分離株中的同源性為90.35%～100%，在羅非魚(yú)源分離株中的同源性為100%。蛋白序列在不同分離株中存在13處變異，其中的11項(xiàng)發(fā)生于法國(guó)人源AL766843和加拿大人源CP007632，另外2處發(fā)生于巴西人源CP010319。ML進(jìn)化樹(shù)顯示法國(guó)人源AL766843和加拿大人源CP007632聚為一支；在余下的15個(gè)分離株中，巴西人源CP010319單為一支；LIP342和余下的13株親緣較近，成為一支(圖3)。

2.4 抗體檢測(cè)

與PBS對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，LIP342免疫組和滅活疫苗免疫組奧利亞羅非魚(yú)在接受免疫后，抗體水平從第1周開(kāi)始顯著提升，并持續(xù)升高到第4周，隨后因攻毒而顯著下降。從第2周開(kāi)始，LIP342免疫組抗體水平一直顯著高于滅活疫苗免疫組(圖4)。

LIP342免疫組和滅活疫苗免疫組的大菱鲆血清抗體水平分別從第1周和第2周開(kāi)始顯著提升，均持續(xù)升高到第4周，隨后因攻毒而顯著下降。LIP342免疫組大菱鲆抗體水平一直顯著高于滅活疫苗免疫組(圖5)。

圖3 LIP342的遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Genetic evolution analysis of LIP342 among different strains

圖4 各組奧利亞羅非魚(yú)血清抗體水平變化Fig.4 Serum antibody levels of O.aureus

不同大寫(xiě)字母表示不同免疫時(shí)間，組內(nèi)抗體水平差異顯著；不同小寫(xiě)字母表示同一時(shí)間，組間抗體水平差異顯著。圖5同

圖5 各組大菱鲆血清抗體水平變化

Fig.5 Serum antibody levels ofS.maximus

2.5 攻毒試驗(yàn)

在免疫后的第4周，以0.1 mL 1×109cfu/mL的無(wú)乳鏈球菌活菌分別對(duì)奧利亞羅非魚(yú)和大菱鲆進(jìn)行攻毒，被攻毒的各組試驗(yàn)魚(yú)在14 d內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的發(fā)病甚至死亡現(xiàn)象，陰性對(duì)照組無(wú)死亡現(xiàn)象。注射疫苗后仍患病的供試魚(yú)臨床癥狀同PBS對(duì)照組相同，出現(xiàn)了眼球紅腫或白濁性突出、體色發(fā)黑、腸道積水、肝臟脆化變大、膽囊腫大等典型癥狀。采集瀕死魚(yú)眼球、肝臟等病灶，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)和LIP342基因擴(kuò)增，確定攻毒后的發(fā)病及死亡現(xiàn)象為該菌所致。

Kaplan-Meier生存檢驗(yàn)結(jié)果顯示，除去陰性對(duì)照組，LIP342免疫組奧利亞羅非魚(yú)和大菱鲆的累積生存率均為最高，其次為滅活疫苗免疫組，二者累積生存率顯著高于PBS對(duì)照組(圖6、7)。LIP342蛋白對(duì)奧利亞羅非魚(yú)和大菱鲆的RPS分別為75.0%和77.3%，均高于滅活疫苗(RPS分別為62.5%和54.5%)(圖8)。

圖6 奧利亞羅非魚(yú)Kaplan-Meier生存曲線Fig.6 Kaplan-Meier survival curves of O.aureus

圖7 大菱鲆Kaplan-Meier生存曲線Fig.7 Kaplan-Meier survival curves of S.maximus

圖8 各免疫組的相對(duì)保護(hù)率Fig.8 Relative percentage survivals of vaccined groups

3 討論

魚(yú)類鏈球菌病從2001年開(kāi)始在中國(guó)以散發(fā)形式出現(xiàn)，受感染的羅非魚(yú)死亡率為5%～15%[8]；從2009年開(kāi)始，無(wú)乳鏈球菌已替代海豚鏈球菌(S.iniae)，成為我國(guó)以羅非魚(yú)為代表的魚(yú)類鏈球菌病的首要致病菌[9]，發(fā)病率高達(dá)20%～50%，死亡率達(dá)50%～70%，甚至更高[10]；到2011年該菌已波及95%以上的羅非魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)，死亡率高達(dá)30%～80%[11]；此后，受感染的種類和地區(qū)日漸增多，發(fā)病規(guī)格亦日趨小型化[12]。但與海豚鏈球菌相比，無(wú)乳鏈球菌對(duì)魚(yú)類的半致死濃度更低[13]，可耐受的藥物種類更少[14]，藥物防治難度更大。而且無(wú)乳鏈球菌含有多種致病性蛋白因子、毒力因子、超抗原(superantigen，SAg)和免疫逃避因子，易引起菌體的變態(tài)反應(yīng)[15]，如不同于以往的β-溶血性、CAMP陽(yáng)性無(wú)乳鏈球菌菌株，我國(guó)廣東已出現(xiàn)γ-溶血性、CAMP陰性的羅非魚(yú)源菌株[16]，并且該菌的一大特點(diǎn)是各血清型間無(wú)交叉免疫作用[6]，因此傳統(tǒng)的滅活疫苗和減毒活疫苗因效力、安全性等問(wèn)題使得應(yīng)用受限，致使無(wú)乳鏈球菌病不易防控。脂蛋白家族成員具有養(yǎng)分?jǐn)z取、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、粘附到宿主細(xì)胞、接合、孢子繁殖、形成耐藥性、轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)胞外折疊等功能，直接參與細(xì)菌的定殖、感染、免疫逃避和調(diào)控，影響宿主機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)[7,17]。脂蛋白家族成員約占無(wú)乳鏈球菌蛋白質(zhì)組的2%，有些成員是該菌重要的毒力因子[18]，也是研發(fā)無(wú)乳鏈球菌疫苗的良好候選目標(biāo)[19]。脂蛋白大多暴露于細(xì)胞表面，屬于表面蛋白[17]，表面蛋白制備的疫苗對(duì)無(wú)乳鏈球菌具有很好的交叉保護(hù)作用[20]，還可能在無(wú)乳鏈球菌感染的各個(gè)階段起到免疫作用[15]，因此針對(duì)血清型眾多、抗原成分復(fù)雜的無(wú)乳鏈球菌，具有免疫原性的保守脂蛋白具有開(kāi)發(fā)安全、高效、實(shí)用疫苗的巨大優(yōu)勢(shì)。

Pereira等[21]利用生物信息學(xué)比對(duì)分析GenBank收錄的包括人、牛、駱駝和羅非魚(yú)源的無(wú)乳鏈球菌基因組，預(yù)測(cè)出了一些高度保守、可作為疫苗靶標(biāo)的抗原蛋白，LIP342即為其中之一。構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET-32a-LIP342在BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中獲得了良好的可溶性表達(dá)。Westren blotting檢驗(yàn)結(jié)果顯示LIP342蛋白具有較好的免疫反應(yīng)原性。無(wú)乳鏈球菌LIP342制備的亞單位疫苗和滅活疫苗均能夠刺激奧利亞羅非魚(yú)和大菱鲆顯著提高血清抗體水平(P<0.05)，并有效抵御1×109cfu/mL無(wú)乳鏈球菌的強(qiáng)毒攻擊(P<0.05)。生物信息學(xué)分析、Western blotting檢驗(yàn)和免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了LIP342蛋白的免疫保護(hù)能力和研發(fā)價(jià)值，這同Pereira等[21]預(yù)測(cè)結(jié)果一致。LIP342蛋白誘導(dǎo)奧利亞羅非魚(yú)和大菱鲆產(chǎn)生的血清抗體水平顯著高于滅活疫苗(P<0.05)，并表現(xiàn)出了較好的累積生存率和RPS，從免疫保護(hù)效果而言，可作為無(wú)乳鏈球菌滅活疫苗替代品的候選因子。近年來(lái)，無(wú)乳鏈球菌致名貴海水養(yǎng)殖魚(yú)類大菱鲆突眼病爆發(fā)頻繁[22]。無(wú)乳鏈球菌LIP342蛋白和滅活疫苗對(duì)大菱鲆具有良好的免疫效果，填補(bǔ)了大菱鲆無(wú)乳鏈球菌疫苗的報(bào)道空白，為其他海水魚(yú)類無(wú)乳鏈球菌病的防控提供參考。

已被證實(shí)一些高度保守的無(wú)乳鏈球菌抗原蛋白具有非常好的交叉免疫作用，如Sip蛋白[20]和Rib蛋白[23]可抗無(wú)乳鏈球菌多種血清型菌株，GapC蛋白更可交叉免疫無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)和乳房鏈球菌(S.uberis)[24]，這是無(wú)乳鏈球菌高度保守的抗原蛋白作為疫苗研發(fā)的一大優(yōu)勢(shì)。LIP342在不同物種來(lái)源或不同血清型無(wú)乳鏈球菌分離株中的同源性為90.35%～100%，在羅非魚(yú)源分離株中的同源性為100%，證明了該蛋白的高度保守性。由此推測(cè)，除奧利羅非魚(yú)和大菱鲆以外，LIP342對(duì)其他易感染無(wú)乳鏈球菌的魚(yú)類甚至牛等哺乳動(dòng)物可能具有相似或相同的免疫保護(hù)功能。此外，羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌BX2012株為Ia血清型，LIB342蛋白對(duì)其他血清型無(wú)乳鏈球菌的免疫效果有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：鄧 薇)

Truncated expression of one lipoprotein ofStreptococcusagalactiaeand its immunoprotection

LIU Hong-yan1,3, ZHANG Yao-guang1, ZHANG Song-lin2, SHEN Zhi-qiang2，MA Yong-biao2

(1.SchoolofLifeSciences,SouthwestUniversity,KeyLaboratoryofFreshwaterFishReproductionandDevelopment(MinistryofEducation),KeyLaboratoryofAquaticScienceofChongqing,Chongqing400715,China;2.ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,Binzhou256600,Shandong,China;3.BinzhouMarineEnvironmentalMonitoringStationofShandongProvince,Binzhou256600,Shandong,China)

The antigenicity and immunoprotection toOreochromisaureusandScophthalmusmaximusof lipoprotein inStreptococcusagalactiaeBX2012 strain isolated from tilapia were analyzed. Specific primers were designed according to B cell linear epitopes of lipoprotein gene sequence (GenBank ID: CP000114.1，SAK_0321 ) predicted by bioinformatics software. The recombinant expression plasmid was structured. Subunit vaccine of lipoprotein after truncated expression and purification was made and researched compared with inactivated vaccine. The results showed that pET-32a-LIP342 prokaryotic expression plasmid was constructed successfully, and soluble recombinant protein with molecular mass of 30 kDa was expressed efficiently in BL21 (DE3). The purity of LIP342 after purification was increased from 41.75% to 87.23%. Homology of LIP342 from all known species or different serotypesS.agalactiaeisolates was 90.35%～100%, and 100% among tilapia isolates. LIP342 was distinguished specifically by high immune serum of rabbit anti-S.agalactiaein Western blotting test. Serum antibody levels and cumulative survival rates after challenged of tilapia and turbot immunized by LIP342 and inactivated vaccine were significantly higher than that of PBS control group. What’s more, serum antibody levels of tilapia and turbot induced by LIP342 was significantly higher than that of inactivated vaccine. So, LIP342 was proved as a conserved antigen with good immunogenicity and a subunit vaccine candidate to fish againstS.agalactiae.

Streptococcusagalactiae; lipoprotein; truncated expression; immunoprotection;Oreochromisaureus;Scophthalmusmaximus

2017-03-28

2017-04-13

重慶市重大應(yīng)用開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(CSTC2014yykfc80001)

劉鴻艷(1980- )，女，博士研究生，專業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail：hongyanfish@163.com

張耀光。E-mail：zhangyg@swu.edu.cn

S942.5

A

1000-6907-(2017)03-0025-08