姚佳俊，李 忠，梁宏偉，羅相忠，王 丹，鄒桂偉

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因的克隆及其在細(xì)菌感染條件下的表達(dá)分析

姚佳俊1,2，李 忠2，梁宏偉2，羅相忠2，王 丹2，鄒桂偉2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

為了解c型溶菌酶基因與長(zhǎng)豐鯽(ChangFengCarassiusauratus)的抗菌效應(yīng)關(guān)系，本研究利用同源克隆方法獲得長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因cDNA全長(zhǎng)序列。結(jié)果顯示：c型溶菌酶基因全長(zhǎng)698 bp，包括5′端非翻譯區(qū)60 bp，3′端非翻譯區(qū)200 bp，開放閱讀框438 bp，編碼145個(gè)氨基酸。長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因在腎臟組織中表達(dá)量最大，在脾臟、腸道、心臟和腦中大量表達(dá)，在肝臟和鰓中表達(dá)量相對(duì)較低，在皮膚和肌肉中幾乎不表達(dá)。長(zhǎng)豐鯽在感染遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌后，在肝臟、腎臟、脾臟和鰓等組織中基因表達(dá)量均發(fā)生顯著變化，出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。感染遲鈍愛德華氏菌后，在脾臟中的上調(diào)幅度最大，其次為鰓、肝臟和腎臟；感染嗜水氣單胞菌后，在脾臟中上調(diào)程度最大，其次是鰓；感染金黃色葡萄球菌后，在脾臟中上調(diào)幅度最大。在肝臟和腎臟中，經(jīng)金黃色葡萄球菌刺激后c型溶菌酶基因的上調(diào)幅度最高；在脾臟和鰓中，經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后c型溶菌酶基因上調(diào)幅度最高。三種刺激后，c型溶菌酶基因升高幅度的不同，說明不同刺激使魚體組織產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)能力不同。

長(zhǎng)豐鯽(ChangFengCarassiusauratus)；c型溶菌酶基因；克??；表達(dá)分析；抗細(xì)菌效應(yīng)

溶菌酶根據(jù)其來源與氨基酸序列差異可分為6類：雞蛋清溶菌酶、鵝溶菌酶、細(xì)菌溶菌酶、無脊椎動(dòng)物溶菌酶、植物溶菌酶和噬菌體溶菌酶[1]。其中，c型溶菌酶在脊椎動(dòng)物與無脊椎動(dòng)物中均有存在[2]。目前在圓鲆(Bothusassimilis)、塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、鯉(Cyprinuscarpio)和斑馬魚(Barchydanioreriovar)等魚類中均有研究報(bào)道[3,4]。

溶菌酶在魚類非特異免疫研究中具有重要作用，溶菌酶通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，從而使革蘭氏陽性細(xì)菌溶解；也可以通過與一些陽離子乳鐵蛋白、防御素、抗菌肽等協(xié)同作用，溶解革蘭氏陰性細(xì)菌的外壁脂多糖[5]。研究表明：草魚(Ctenopharyngodonidellus)和塞內(nèi)加爾鰨c型溶菌酶在各組織均有表達(dá)，其中草魚頭腎中表達(dá)量最高，塞內(nèi)加爾鰨皮膚和鰓的表達(dá)量較高。菱鲆(Scophthalmusrhombus)c型溶菌酶在肝臟和胃中的表達(dá)量較高[4,6-7]。斑點(diǎn)叉尾(IetalurusPunetaus)和牙鲆經(jīng)愛德華氏菌刺激后，脾臟和頭腎等組織中c型溶菌酶基因表達(dá)量均升高[8,9]，淇河鯽(QiheCarassiusauratus)經(jīng)嗜水氣單胞菌刺激后，c型溶菌酶基因在肝臟和脾臟中表達(dá)量上升，在鰓中的表達(dá)量先上升后下降[10]，研究結(jié)果表明魚類受到外界刺激時(shí)，c型溶菌酶基因會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)。

長(zhǎng)豐鯽(ChangFengCarassiusauratus)是我國(guó)第一個(gè)通過全國(guó)水產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)審定的四倍體異育銀鯽新品種(品種登記號(hào)：GS-04-001-2015)。作為一個(gè)養(yǎng)殖新品種，其對(duì)細(xì)菌性疾病的抵抗力如何也是一個(gè)十分重要的性能指標(biāo)。因此，本研究以長(zhǎng)豐鯽為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶進(jìn)行了基因克隆，從分子水平上研究其結(jié)構(gòu)和功能，分析在感染細(xì)菌條件下肝臟、腎臟、脾臟和鰓中的表達(dá)變化特征，研究長(zhǎng)豐鯽的抗細(xì)菌效應(yīng)，為探討長(zhǎng)豐鯽抗細(xì)菌性疾病能力提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)魚均為健康無病無傷的長(zhǎng)豐鯽(150±0.5) g，取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所荊州基地窯灣試驗(yàn)場(chǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)魚處理

隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)魚分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，每組60尾，暫養(yǎng)兩周。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌的感染實(shí)驗(yàn)，注射濃度分別為2.2×106， 6.0×107，4.5×105cfu/mL，150 μL，對(duì)照組注射等量0.9%的生理鹽水，維持水溫(28±2) ℃，持續(xù)增氧。實(shí)驗(yàn)開始前，隨機(jī)選取5尾魚取皮膚，肌肉，肝臟，腎臟，脾臟，鰓，腦，心臟和腸等組織用于 c型溶菌酶基因的組織表達(dá)分析，實(shí)驗(yàn)開始后0、6、12、24、48、72、96、120 h取肝臟、腎臟、脾臟、鰓等組織迅速放入液氮中，用于后續(xù)研究。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌菌種均由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所魚類病害研究室提供。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司； PrimeScriptTMRT Reagen Kit with gDNA Eraser、PMD?18-T Vector system和SYBR?Premix Ex TaqTMII購(gòu)自大連寶生物工程有限公司(Takara)； Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit購(gòu)自北京百泰克生物有限公司(Bioteke)； SMART RACE cDNA Amplication Kit購(gòu)自美國(guó)Clontech公司；Trans5á化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京金式金生物(TransGen Biotech)。熒光定量PCR儀為Qiagen公司生產(chǎn)的Rotor-Gene 6200 system，紫外分光光度計(jì)為UNICO公司的UV-3802紫外分光光度計(jì)，凝膠成像系統(tǒng)為Syngene公司的G:BOX。

1.1.5 引物

根據(jù)GenBank中已知物種c型溶菌酶基因 cDNA序列設(shè)計(jì)引物c lzm 1擴(kuò)增c型溶菌酶基因中間片段，設(shè)計(jì)引物c lzm 3和c lzm 5擴(kuò)增c型溶菌酶基因的3′端和5′端。c-q-lzm 1為定量表達(dá)的特異性引物；β-actin 1為定量表達(dá)的內(nèi)參引物，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中鯽(C.auratus，GenBank:AB039726.2) β-actin基因序列設(shè)計(jì)。以上引物均采用Primer 5.0設(shè)計(jì)，由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used for the experiment

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成

使用Trizol Reagent試劑并根據(jù)其說明書提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度；凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性；以總RNA為模板，使用PrimeScriptTMRT Reagen Kit with gDNA Eraser試劑并按照說明書合成cDNA。

1.2.2 3′RACE和5′RACE擴(kuò)增

按照SMART RACE cDNA Amplication Kit (Clontech)說明書，采用引物c lzm 3和c lzm 5及試劑盒提供的通用引物擴(kuò)增c型溶菌酶基因的3′端和5′端。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)、回收、連接、轉(zhuǎn)化后，挑單克隆菌落送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析

用ContigExpress軟件對(duì)已獲得序列進(jìn)行拼接，用DNAMAN軟件對(duì)所得序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，用Clustal W 和 MEGA 5.0軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多序列比較和聚類分析。

1.2.4 長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因 mRNA表達(dá)的半定量PCR檢測(cè)

利用引物c-q-lzm 1和β-actin 1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)c型溶菌酶基因在皮膚、肌肉、肝臟、腎臟、脾臟、腦、鰓、心臟、腸等組織中的表達(dá)情況。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用引物c-q-lzm 1和β-actin 1檢測(cè) c型溶菌酶基因在健康長(zhǎng)豐鯽各組織及細(xì)菌感染后長(zhǎng)豐鯽肝臟、腎臟、脾臟和鰓中的表達(dá)情況。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMII 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)以減少誤差，用 2-ΔΔCt分析方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，具體方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Means±Standard error (SE)形式表示， Duncan’s多重比較進(jìn)行單因素方差分析，顯著性差異為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因序列分析

長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因全長(zhǎng)698 bp，包括5′端非翻譯區(qū)60 bp，3′端非翻譯區(qū)200 bp，開放閱讀框438 bp，編碼145個(gè)氨基酸。有真核細(xì)胞加尾信號(hào)(ATTAAA)和Poly(A)尾巴[13](圖1)。

圖1 長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因cDNA全長(zhǎng)序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of the ChangFeng C.auratus c-type lysozyme cDNA and its deduced amino acids sequence “□”表示起始密碼子和終止密碼子；灰色區(qū)域表示加尾信號(hào)

2.2 長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因的同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用DNAMAN軟件將GenBank中已知一些物種和長(zhǎng)豐鯽的c型溶菌酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明c型溶菌酶基因氨基酸序列在分子進(jìn)化過程中較保守，與鯉形目魚類有較高的同源一致性，其中，與鯽、異育銀鯽(C.auratusgibelio)、鯉魚相似度最高分別為99%、98%、90%，與青魚(Mylopharyngodonpiceus)、草魚、斑馬魚等鯉形目魚類同源性在80%左右，與其他物種如人(Homosapiens)、牦牛(Bosgrunniens)、原雞(Gallusgallus)等哺乳動(dòng)物和鳥類的同源性則相對(duì)較低，在40%～50%之間(圖2)。

圖2 長(zhǎng)豐鯽與其它物種c型溶菌酶基因氨基酸多序列比對(duì)Fig.2 Multiple alignments of the deduced amino acid of c-type lysozyme with other species黑色表示氨基酸序列一樣，灰色表示氨基酸序列相對(duì)保守，數(shù)字表示不同序列氨基酸的位置。

使用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining(NJ法)構(gòu)建長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步可以看出:長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因與鯽魚和異育銀鯽的親緣關(guān)系最近，與鯉形目的魚類聚為一支；人、樹鼩(Tupaiachinensis)、家鼠(Musmusculus)、灰倉(cāng)鼠(Cricetulusmigratorius)的c型溶菌酶基因聚為一支；原雞和綠領(lǐng)原雞(Gallusvarius)、青鳉(Oryziaslatipes)、獼猴(Macacamulatta)、大猩猩(Gorillagorilla)、牦牛、綿羊(Ovisaries)和山羊(Caprahircus)聚為一支(圖3)。

圖3 c型溶菌酶基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.3 Phylogenetic tree of vertebrate c-type lysozyme

2.3 長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因組織表達(dá)分析

用半定量和實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種方法檢測(cè)c型溶菌酶基因在長(zhǎng)豐鯽皮膚、肌肉、脾臟、腎臟、肝臟、鰓、心臟、腸和腦等組織中的表達(dá)情況(圖4和圖5)。兩種方法檢測(cè)的結(jié)果基本一致，c型溶菌酶基因在腎臟中表達(dá)量最高，在脾臟、腸道、心臟和腦中大量表達(dá)，在肝臟和鰓中表達(dá)量相對(duì)較低，在皮膚和肌肉中幾乎不表達(dá)。

圖4 c型溶菌酶基因在不同組織中的表達(dá) (RT-PCR檢測(cè))Fig.4 Tissue distribution of c-type lysozyme mRNA in ChangFeng Carassius auratus (with RT-PCR)

圖中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、M分別代表皮膚、肌肉、脾臟、腎臟、肝臟、鰓、腸、心臟、腦、對(duì)照組和marker。對(duì)照組為陰性對(duì)照，即加樣時(shí)只添加了引物，沒有加cDNA模板。

2.4 細(xì)菌感染對(duì)長(zhǎng)豐鯽組織c型溶菌酶基因的表達(dá)影響

由圖6可以看出：長(zhǎng)豐鯽在感染遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌后，在肝臟、腎臟、脾臟和鰓等組織中基因表達(dá)量均發(fā)生顯著變化，出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。感染遲鈍愛德華氏菌后，在脾臟中的上調(diào)幅度最大，為對(duì)照組的27倍，其次為鰓、肝臟和腎臟；感染嗜水氣單胞菌后，在脾臟中表達(dá)量最大，其次是鰓，分別為對(duì)照組的160倍和82倍；感染金黃色葡萄球菌后，在脾臟中上調(diào)幅度最大，為對(duì)照組的15倍。在肝臟和腎臟中(圖6 A，B)，經(jīng)金黃色葡萄球菌刺激后c型溶菌酶基因的上調(diào)幅度最高；在脾臟和鰓(圖6 C，D)中，經(jīng)嗜水氣單胞菌感染后c型溶菌酶基因上調(diào)幅度最高。三種細(xì)菌感染后不同組織c型溶菌酶基因表達(dá)不同，暗示不同細(xì)菌使魚體組織產(chǎn)生不同的應(yīng)激反應(yīng)能力。

圖5 c型溶菌酶基因在不同組織中的表達(dá) (熒光定量PCR檢測(cè))Fig.5 Tissue distribution of c-type lysozyme mRNA in ChangFeng Carassius auratus (with real-time quantitative PCR)

skin，muscle，spleen，kidney，liver，gill，intestines，heart，brain，Control分別表示皮膚、肌肉、脾臟、腎臟、肝臟、鰓、腸、心臟、腦和對(duì)照組。

圖6 注射細(xì)菌條件下c型溶菌酶基因在肝臟(A)、腎臟(B)、脾臟(C)和鰓(D)中的表達(dá)Fig.6 Effect of bacteria injection on c-type lysozyme mRNA levels in liver(A),kidney(B),spleen(C) and gill(D)0、6、12、24、48、72、96、120 h表示魚體感染細(xì)菌時(shí)間。設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)平行組， 每個(gè)采樣點(diǎn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行組各取5條魚，每個(gè)組織樣品重復(fù)三次。

3 討論

3.1 長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因cDNA序列分析

魚類c型溶菌酶cDNA 全長(zhǎng)約為600～700 bp[10]，文昌魚(Branchiostomalanceolatum)c型溶菌酶cDNA全長(zhǎng)651 bp，編碼140個(gè)氨基酸[13]；草魚c型溶菌酶cDNA全長(zhǎng)685 bp，編碼145個(gè)氨基酸[6]；淇河鯽c型溶菌酶cDNA全長(zhǎng)679 bp，編碼145個(gè)氨基酸[10]。圖1顯示長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶cDNA全長(zhǎng)698 bp，編碼145個(gè)氨基酸。魚類的親緣關(guān)系越近，溶菌酶的同源性越高，長(zhǎng)豐鯽和鯽、異育銀鯽同為鯉科魚類，氨基酸序列相似性顯示長(zhǎng)豐鯽和鯽、異育銀鯽的c型溶菌酶基因同源性分別為99%和98%，在進(jìn)化樹上三者的親緣關(guān)系最近，長(zhǎng)豐鯽與其他鯉形目魚類如鯉、斑馬魚、青魚、草魚的c型溶菌酶基因氨基酸同源性分別為90%、81%、80%、79%，推測(cè)c型溶菌酶基因在鯉形目魚類長(zhǎng)期進(jìn)化過程中是高度保守的，但是長(zhǎng)豐鯽與其他物種如人、牦牛等哺乳動(dòng)物和鳥類的同源性相對(duì)較低，在40%～50%之間，由此推測(cè)鯉形目魚類的c型溶菌酶基因在進(jìn)化過程中具有相對(duì)獨(dú)立性。

在多數(shù)生物中c型溶菌酶僅存在一種，但隨著生物的進(jìn)化，一些物種中存在多種c型溶菌酶。如在盤鮑(Haliotisdiscusdiscus)和大西洋鮭(Salmosalar)中均有兩種c型溶菌酶[14,15]，澳大利亞羅非魚(Oreochromisaureus)中有三種c型溶菌酶[16]，在反芻動(dòng)物中有多達(dá)十種的溶菌酶[17]，這些多類型溶菌酶在生物機(jī)體內(nèi)有著不同的功能作用。長(zhǎng)豐鯽中是否存在多種c型溶菌酶，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 組織表達(dá)分析

魚類c型溶菌酶基因的表達(dá)具有種屬和組織特異性，不同魚類及不同組織的表達(dá)量均有差異。如淇河鯽c型溶菌酶在腎臟和頭腎中表達(dá)量較高，分別是肝臟的188.6倍和316.7倍[10]。牙鲆c型溶菌酶在頭腎、后腎、脾臟中具有較高表達(dá)量[19]；點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides)c型溶菌酶基因主要在血、鰓、頭腎中表達(dá)量較高[18]。長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶在檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，且在腎臟中的表達(dá)量高于其它組織，推測(cè)是由于魚體內(nèi)溶菌酶的產(chǎn)生與哺乳動(dòng)物相似，主要由單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，少量由巨噬細(xì)胞生成，在魚體血流量較豐富的腎臟、脾臟等組織中，這些單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等將分泌溶菌酶進(jìn)入這些組織[9]。因此，長(zhǎng)豐鯽 c型溶菌酶在腎臟中高表達(dá)，說明腎臟可能在免疫防御中具有重要作用。

3.3 細(xì)菌感染對(duì)c型溶菌酶基因表達(dá)的影響

遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛存在。本實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)豐鯽在接受不同病原刺激時(shí)，c型溶菌酶基因在不同組織中均呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)，這與斑點(diǎn)叉尾[8]、牙鲆[9]細(xì)菌感染后的結(jié)果相似，說明c型溶菌酶基因具有抵御細(xì)菌入侵的功能；在不同組織中出現(xiàn)高峰的時(shí)間、升幅與高水平表達(dá)量維持時(shí)間等均有所不同，這與草魚[6]、淇河鯽[10]的研究結(jié)果相似，推測(cè)長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因在不同組織中存在不同的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，不同時(shí)間點(diǎn)在不同組織中采取不同的調(diào)節(jié)方式進(jìn)行表達(dá)，從而維持機(jī)體穩(wěn)定。三種細(xì)菌刺激后長(zhǎng)豐鯽c型溶菌酶基因表達(dá)升高量不同，這與淇河鯽的研究結(jié)果類似[10]，說明不同刺激可能使魚體產(chǎn)生的非特異性免疫反應(yīng)和不同組織中c型溶菌酶的應(yīng)激反應(yīng)能力不同，這也可能是革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌所引起的差異，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

不同細(xì)菌刺激下c型溶菌酶基因表達(dá)變化說明c型溶菌酶可能具有一定的防御功能，它可以抵御外界病原菌的入侵，以增強(qiáng)機(jī)體的抗病、抗感染能力。該研究結(jié)果為我們進(jìn)行抗病品種選育積累了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

[1]Bachali S,Jager M,Hassanin A, et al. Phylogenetic analysis of invertebrate lysozymes and the evolution of lysozyme function [J].J Mol Evol,2002,54(5):652-664.

[2]賈向志,李 元,馬文煜.溶菌酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2002,13(5):374-377.

[3]Liu F,Wen Z.Cloning and expression pattern of the lysozyme C gene in Zebrafish [J].Mech Dev,2002,113(1):69-72.

[4]Fernández T M A,Porta J,Manchado M,et al.c/Lysozyme from Senegalese sole (Soleasenegalensis):cDNA cloning and expression pattern [J].Fish Shellfish Immunol,2008,25(5):697-700.

[5]Callewaert L,Michiels C W.Lysozymes in the animal kingdom [J].J Biosci,2010,35(1):127-160.

[6]Ye X,Zhang L,Tian Y,et al.Identification and expression analysis of the g-type and c-type lysozymes in grass carpCtenopharyngodonidellus[J].Dev Comp Immunol,2010,34(5):501-509.

[7]Jiménez C R M,Infante C,Martin A B,et al.Molecular characterization,phylogeny,and expression of c-type and g-type lysozymes in brill (Scophthalmusrhombus) [J].Fish Shellfish Immunol,2008,25(1):57-65.

[8]Wang R,Feng J,Li C,etal. Four lysozymes (one c-type and three g-type) in catfish are drastically but differentially induced after bacterial infection [J].Fish Shellfish Immunol,2013,35(1):136-145.

[9]Minagawa S,Hikima J,Hirono I,etal. Expression of Japanese flounder c-type lysozyme cDNA in insect cells [J].Dev Comp Immunol,2001,25(5):439-445.

[10]王美娟.淇河鯽c型和g型溶菌酶基因克隆及表達(dá)分析[D].河南新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué),2015.

[11]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod [J].Methods,2001,25(4):402-408.

[12]錢 曦,華雪銘,黃旭雄,等.異育銀鯽c型溶菌酶全長(zhǎng)cDNA序列的生物信息學(xué)分析及其組織表達(dá)分析[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2008,24(4):337-347.

[13]Liu M,Zhang S,Liu Z,etal. Characterization,organization and expression of AmphiLysC,an acidic c-type lysozyme gene in amphioxus BranchiostomaBelcheriTsingtauense[J].Gene,2006,367:110-117.

[14]Umasuthan N,Bathige S,Kasthuri S R,etal. Two duplicated chicken-type lysozyme genes in disc abalone Haliotis discus discus:molecular aspects in relevance to structure,genomic organization,mRNA expression and bacteriolytic function [J].Fish Shellfish Immunol,2013,35(2):284-299.

[15]Ng S H S,Artieri C G,Bosdet I E,etal. A physical map of the genome of Atlantic salmon,Salmo salar [J].Genomics,2005,86(4):396-404.

[16]禹紹國(guó),葉 星,張莉莉,等.奧利亞羅非魚3種C型溶菌酶基因的克隆及其序列分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2010(1):66-74.

[17]Irwin D M,Wilson A C.Multiple cDNA sequences and the evolution of bovine stomach lysozyme [J].J Biol Chem,1989,264(19):11387-11393.

[18]Wei S,Huang Y,Cai J,etal. Molecular cloning and characterization of c-type lysozyme gene in orange-spotted grouper,Epinephelus coioides [J].Fish Shellfish Immunol,2012,33(2):186-196.

[19]Schnyder J,Baggiolini M.Secretion of lysosomal hydrolases by stimulated and nonstimulated macrophages [J].J Exp Med,1978,148(2):435-450.

(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Molecular cloning and expression analysis of c-type lysozyme gene inChangFeng Carassius auratus during bacterial infection

YAO Jia-jun1,2,LI Zhong2,LIANG Hong-wei2,LUO Xiang-zhong2,WANG Dan2,ZOU Gui-wei2

(1.CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;2.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China)

To understand the biological role of c-type lysozyme in the ChangFengC.auratus,in this study,c-type lysozyme is cloned by homology cloning strategy from ChangFengCarassiusauratus.The results showed that the full length cDNA sequence of c-type lysozyme is 698 bp,including a 438 bp open reading frame with a coding potential for a 145-amino acid protein,a 60 bp 5′-untranslated region and a 200 bp 3′- untranslated region.c-type lysozyme mRNA was expressed ubiquitously in the tissues examined and abundantly expressed in kidney,It had a large number of expression In the spleen,intestine,heart and brain,but in the liver and gills the expression was relatively low,almost no expression in the skin and muscle.After intraperitoneal injection withEdwardsiellatarda,AeromonashydrophilaandStaphylococcusaureusrespectively,the mRNA levelsofc-typelysozyme was more or less rapidly upregulated in liver,kidney,spleen and gill.After intraperitoneal injection withEdwardsiellatarda,higher degree of the mRNA levels of c-type lysozyme was largest in spleen,followed by gills,liver and kidney;After intraperitoneal injection withAeromonashydrophila,escalation of the mRNA levels of c-type lysozyme was largest in spleen,followed by gills;After intraperitoneal injection withStaphylococcusaureus,up-regulation of the mRNA levels of c-type lysozyme was largest in spleen.In liver and kidney,the uptake rate of the c-type lysozyme gene was the highest when stimulated byStaphylococcusaureus.But in spleen and gill,the up-scaling of the mRNA levels of c-type lysozyme gene was the highest when stimulated byAeromonashydrophila.After the stimulation of three bacteria,higher degree of the mRNA levelsofc-typelysozyme was different,It showed different stimulus may make different stress reaction ability in the fish tissue.

ChangFengCarassiusauratus;c-type lysozyme;clone;expression;antibacterial effect

2017-01-18；

2017-03-27資助項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD26B02)資助[Supported by Key Projects of the National Science & Technology (2012BAD26B02)]

姚佳俊(1990- )，女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)轸~類遺傳育種。E-mail:1518657804@qq.com

鄒桂偉。E-mail:Zougw@yfi.ac.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)03-0033-08