許曉瀟,楊秀清

(山西大學 生物技術(shù)研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

紅球菌R04細胞分裂相關(guān)蛋白RHOGL008438對大腸桿菌細胞絲狀化的影響

許曉瀟,楊秀清*

(山西大學 生物技術(shù)研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

通過轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)紅球菌R04的RHOGL008438蛋白可能與細胞分裂有關(guān)。為研究其生理功能,通過構(gòu)建融合表達質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中異源表達RHOGL008438蛋白,并在熒光顯微鏡下觀察該蛋白對大腸桿菌細胞形態(tài)的影響。結(jié)果表明,過量表達RHOGL008438蛋白會使大腸桿菌細胞出現(xiàn)絲狀化,絲狀化程度與IPTG誘導濃度呈劑量效應關(guān)系,且培養(yǎng)時間越長,細胞絲狀化程度越高。IPTG濃度為0.5 mmol/L時培養(yǎng)5 h后細胞長度可達46.2 μm,表明RHOGL008438蛋白干擾了大腸桿菌細胞隔膜的正常形成導致細胞絲狀化。通過序列同源性分析,確定RHOGL008438蛋白為細胞分裂過程中的主要分裂蛋白FtsZ。

紅球菌R04;細胞分裂蛋白;細菌細胞分裂;異源表達

細菌細胞分裂過程中,第一個分裂蛋白FtsZ定位于分裂位點并且聚合形成Z環(huán),然后招募其他約20種分裂蛋白形成分裂小體[1-2],分裂小體隨后收縮,拉動細胞膜以促進胞質(zhì)分裂[3]。細胞分裂蛋白FtsZ是一種GTP酶,該酶的活性依賴于FtsZ蛋白的表達水平,FtsZ的N端被認為是對GTP依賴性聚合起重要作用的活性部位,而C端是FtsZ蛋白與其他細胞分裂蛋白相互作用的區(qū)域[4]。FtsZ蛋白在正常細菌細胞周期中發(fā)揮的作用是獨一無二的,然而當FtsZ蛋白表達異常后如胞內(nèi)濃度異常升高或降低,會使得細菌細胞分裂受阻,細菌細胞形態(tài)呈現(xiàn)絲狀化[5]。ftsZ基因的序列與功能都是高度保守的,在細菌中僅存有一個拷貝[6]。

大腸桿菌細胞中其它分裂組分未改變時,FtsZ蛋白的過量表達會導致細胞分裂機制的不平衡,抑制細胞分裂[7]。將牙齦卟啉單胞菌的FtsZ蛋白在大腸桿菌中異源過表達后會導致大腸桿菌細胞形成絲狀化[8];結(jié)核分枝桿菌FtsZ基因在其自身體內(nèi)過量表達時,會使結(jié)核桿菌細胞絲狀化[9];宿主根瘤菌中,同源或異源的FtsZ蛋白在過表達后會由于細胞壁向外生長時殘留在細胞的中間位置而形成分支狀結(jié)構(gòu)[10];球狀細菌如革蘭氏陽性病原菌金黃色葡萄球菌中當FtsZ耗盡時細胞持續(xù)生長且不再分裂,會產(chǎn)生長的絲狀細胞[11],最終細胞裂解。

紅球菌(Rhodococcussp.)R04基因組與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果注釋為細胞分裂相關(guān)蛋白功能的基因RHOGL008438推測為ftsZ基因,我們從GenBank數(shù)據(jù)庫中提取6條其他菌屬的ftsZ基因序列,應用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖1),結(jié)果表明紅球菌R04 RHOGL008438基因序列與其他菌屬ftsZ基因序列表現(xiàn)出極高的親緣關(guān)系,與結(jié)核分枝桿菌的驗證可信度達到100,由此可以說明該序列即為ftsZ基因序列。該基因的生理功能目前尚不清楚。我們課題組之前的研究發(fā)現(xiàn),以聯(lián)苯為唯一碳源培養(yǎng)紅球菌R04時,其細胞會出現(xiàn)絲狀化,且隔膜形成異常,通過實時熒光PCR方法檢測RHOGL008438蛋白的表達情況,隨著聯(lián)苯濃度的增大,RHOGL008438蛋白的表達量下降(結(jié)果未顯示),說明聯(lián)苯影響了RHOGL008438蛋白的表達,進而影響了紅球菌R04細胞的分裂。本研究為了證實RHOGL008438為細胞分裂相關(guān)基因,將其與pET-21a載體構(gòu)建融合表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細胞中,IPTG誘導表達后,在熒光顯微鏡下觀察其對大腸桿菌細胞分裂的影響,以期確定RHOGL008438蛋白的生理功能。這對進一步研究紅球菌R04細胞的分裂有著重要的意義。

注:Bootstrap驗證次數(shù)為1 000;樹枝上的數(shù)值為驗證可信度;圖左下端標尺表示堿基置換頻率Fig.1 Phylogenetic tree of Rhodococcus sp. R04 RHOGL008438 gene sequence圖1 紅球菌R04 RHOGL008438基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

實驗所用的E.coliDH5a、E.coliBL21(DE3)、紅球菌R04及載體pET-21a均由本實驗室保存。所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基:5 g酵母膏,10 g胰蛋白胨,5 g氯化鈉,加水定容至1 L。

1.2 主要試劑和儀器

FastPfu DNA Polymerase購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ,T4 DNA連接酶購于大連寶生物工程有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購于上海生工生物工程有限公司;細胞膜染料FM1-43購于北京海德生物技術(shù)有限公司;日立UV-2010分光光度計(Hitachi Instruments公司);恒溫震蕩培養(yǎng)箱2HWY-200D(上海智城分析儀器制造有限公司)；Delta Vision Deconvolution microscope(美國Delta Vision公司)。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1.3.1 引物設計

根據(jù)RHOGL008438基因序列,通過Primer5.0軟件設計引物,上游引物F:5′-TAGAATTCATGACGCCCCCGCACAACTACC-3′(EcoR Ⅰ);下游引物R:5′-TAAAGCTTTCAACGGCGCATGAAGATCGGC-3′(Hind Ⅲ),引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2 PCR擴增目的基因

以紅球菌R04基因組DNA為模板,擴增RHOGL008438基因,PCR反應條件:94℃ 5 min,94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 60 s,30個循環(huán),72℃ 10 min,獲得目的基因DP,膠回收純化PCR產(chǎn)物。

1.3.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建和篩選

分別將基因DP與表達載體pET-21a通過限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ進行雙酶切,酶切產(chǎn)物膠回收后在T4 DNA ligase的作用下16℃ 過夜連接,轉(zhuǎn)化入E.coliDH5a感受態(tài)細胞中,在含有氨芐青霉素(終濃度為50 μg/mL)的LB平板上培養(yǎng)。通過菌落PCR篩選陽性重組質(zhì)粒pET-21a-DP,Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切驗證,送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 RHOGL008438蛋白的表達

將測序成功的重組質(zhì)粒pET-21a-DP轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中,挑取單菌落接入含有氨芐青霉素(終濃度為50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中,37℃ 培養(yǎng)至OD600達到0.6時,加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導,16℃,180 r/min恒溫震蕩過夜培養(yǎng)。8 000 r/min離心10 min收集菌體,Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L,pH 8.0)洗滌菌體,菌體重懸于緩沖液中。超聲破碎菌體(間歇5 s,工作3 s,30個循環(huán)),12 000 r/min離心30 min,分別取全菌、上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測分析,經(jīng)考馬斯亮藍染色與脫色后觀察實驗結(jié)果。

1.5 熒光顯微鏡觀察

將pET-21a-DP和pET-21a分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中,在含有氨芐青霉素(終濃度為50 μg/mL)的LB平板上培養(yǎng),分別挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中,37℃,180 r/min震蕩培養(yǎng)。待生長至OD600達到0.6時分別加入終濃度為0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG進行誘導,16℃,180 r/min震蕩培養(yǎng),每個濃度做3個平行。上述培養(yǎng)的菌液,每隔1 h分別取樣測量OD600值,同時進行膜染料FM1-43染色:取1 mL菌液,8 000 r/min離心5 min收集菌體,磷酸緩沖液(20 mmol/L,pH 8.0)洗滌菌體2次,膜染料FM1-43(終濃度為0.1 μg/mL)避光染色5 min,磷酸緩沖液洗滌2次,重懸于1 mL磷酸緩沖液中。取20 μL處理好的菌液滴于載玻片上,蓋玻片直接壓片,用玻璃纖維密封脂將蓋玻片邊緣密封。Delta Vision去卷積熒光顯微鏡下100倍物鏡觀察,激發(fā)波長為488 nm[12]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

隨機選取Delta Vision去卷積熒光顯微鏡下拍攝的圖片,利用softworx explorer中長度測量工具測量大腸桿菌細胞的長度,每個樣統(tǒng)計細胞數(shù)為100個,分別做3個平行。將所得數(shù)據(jù)導入Excel工作表中,統(tǒng)計不同細胞長度各占的百分比,所得數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標準偏差。利用Origin 9軟件作圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 目的基因的獲得

以紅球菌R04基因組為模板,通過PCR的方法擴增RHOGL008438基因,產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖2所示。在1 200 bp處擴增出目的條帶,與預期結(jié)果一致。

2.2 表達載體的構(gòu)建和鑒定

用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,結(jié)果如圖3所示,3泳道中RHOGL008438基因條帶與pET-21a載體分離,大小符合預期。測序結(jié)果表明，序列正確,重組質(zhì)粒pET-21a-DP構(gòu)建成功。

2.3 RHOGL008438蛋白的表達

重組質(zhì)粒pET-21a-DP轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中,經(jīng)IPTG誘導表達,對菌體進行超聲破碎后,分別對全菌、上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測分析,與誘導前相比,獲得特異的新增表達條帶,分子量大小符合預期,結(jié)果如圖4所示,這表明RHOGL008438蛋白在大腸桿菌中成功表達。

注:M為100 bp DNA Ladder;1、2泳道均為RHOGL008438基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 Products of RHOGL008438 gene圖2 RHOGL008438基因的擴增

注:M為1 kb DNA Ladder;1、2和3泳道分別為疑似質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig.3 Identification of recombinant plasmid by digest圖3 雙酶切鑒定重組質(zhì)粒

2.4 過量表達RHOGL008438蛋白對大腸桿菌細胞分裂的影響

2.4.1 過量表達RHOGL008438蛋白對大腸桿菌細胞形態(tài)的影響

注:M為蛋白分子量標準;泳道1-3分別為IPTG誘導后的全菌、上清、沉淀;泳道4-6分別為未誘導的全菌、上清、沉淀Fig.4 SDS-PAGE analysis of RHOGL008438 protein圖4 RHOGL008438蛋白的SDS-PAGE分析

分別將重組質(zhì)粒pET-21a-DP與空載體pET-21a轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中,經(jīng)不同濃度的IPTG誘導,以未經(jīng)IPTG誘導的大腸桿菌細胞作為對照,間隔取樣,膜染料染色后Delta Vision熒光顯微鏡下觀察大腸桿菌的細胞形態(tài)。含有pET-21a的大腸桿菌細胞在IPTG誘導前后其細胞形態(tài)是一致的(圖5A和5B);未誘導的含有融合質(zhì)粒的大腸桿菌細胞形態(tài)(圖5C)與圖5A和5B類似,而經(jīng)IPTG誘導的大腸桿菌細胞形態(tài)變化很大(圖5D-5F),表現(xiàn)為細胞長度的增加,形成絲狀化,說明RHOGL008438蛋白的過表達對大腸桿菌的細胞分裂產(chǎn)生了影響,使其細胞出現(xiàn)絲狀化。

注:A和B分別為含有pET-21a的大腸桿菌細胞IPTG誘導前與誘導后的形態(tài);C-F均為含有pET-21a-DP的大腸桿菌細胞形態(tài),其中,C:未經(jīng)IPTG誘導;D:0.1 mmol/L IPTG誘導1 h;E:0.2 mmol/L IPTG誘導1 h;F:0.5 mmol/L IPTG誘導5 hFig.5 Fluorescence micrograph of E.coli cells圖5 大腸桿菌細胞的熒光顯微鏡圖

2.4.2 不同濃度IPTG誘導下大腸桿菌細胞長度百分比

為了研究紅球菌R04的RHOGL008438蛋白對大腸桿菌細胞分裂的影響,分別加入終濃度為0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG對轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pET-21a-DP的大腸桿菌細胞進行誘導培養(yǎng),間隔1 h進行取樣, Delta Vision熒光顯微鏡下觀察,測量統(tǒng)計不同細胞長度所占的百分比。由圖6可以看出IPTG誘導RHOGL008438蛋白表達影響了宿主大腸桿菌的細胞形態(tài),使菌體呈現(xiàn)絲狀化,細胞長度隨著IPTG誘導時間的延長而增大,同時IPTG誘導濃度增大,細胞長度也隨之增大。IPTG濃度為0.1 mmol/L時,培養(yǎng)1 h后細胞長度為2～6 μm；當培養(yǎng)2 h后,細胞長度達18～22 μm；3 h后細胞長度最大可達到26～30 μm；培養(yǎng)4～5 h后，細胞長度可達30～34 μm(圖6A)。當IPTG濃度增大到0.5 mmol/L時(圖6E),培養(yǎng)2 h時最長細胞長度為34～38 μm,培養(yǎng)5 h后細胞長度最長可達46～50 μm。

雖然在不同IPTG誘導濃度不同培養(yǎng)時間下最大細胞長度不盡相同,但不同IPTG誘導濃度下培養(yǎng)1 h后所占比例最大的細胞長度范圍基本一致,均為2～6 μm;誘導2 h后,IPTG濃度為0.1～0.3 mmol/L時,所占比例最大的細胞長度范圍仍為2～6 μm,而IPTG濃度為0.4～0.5 mmol/L時所占比例最大的細胞長度范圍為6～10 μm;誘導3～4 h,不同IPTG誘導濃度下所占比例最大的細胞長度范圍仍為6～10 μm;誘導培養(yǎng)5 h后,IPTG濃度為0.2～0.5 mmol/L所占比例最大的細胞長度范圍保持不變,而IPTG濃度為0.1 mmol/L時,所占比例最大的細胞長度范圍變?yōu)?～6 μm。通過跟蹤測量誘導表達了RHOGL008438蛋白的大腸桿菌生物量,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)19 h時的OD600值與培養(yǎng)2 h時相當(數(shù)據(jù)未顯示),說明RHOGL008438蛋白過表達會抑制大腸桿菌細胞的生長分裂,且隨著誘導濃度的增大抑制率增大,菌體不斷增長,最終導致絲狀化的細胞裂解死亡。

注:A:IPTG濃度為0.1 mmol/L;B:IPTG濃度為0.2 mmol/L;C:IPTG濃度為0.3 mmol/L;D:IPTG濃度為0.4 mmol/L;E:IPTG濃度為0.5 mmol/LFig.6 The percentage of cell length on the different time of different concentration with IPTG圖6 不同IPTG濃度誘導下不同時期細胞長度百分比

紅球菌R04基因組與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果注釋為細胞分裂相關(guān)蛋白功能的基因RHOGL008438推測為ftsZ,本研究將其與pET-21a載體構(gòu)建融合表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細胞中經(jīng)IPTG誘導表達,結(jié)果顯示對大腸桿菌細胞的分裂造成了影響,證實RHOGL008438為細胞分裂相關(guān)蛋白,通過對不同IPTG誘導濃度下不同時期的細胞長度進行測量統(tǒng)計,說明大腸桿菌細胞隔膜的形成受到干擾,基于序列同源性分析,表明RHOGL008438蛋白確實為細胞分裂過程中主要的分裂蛋白FtsZ。

3 討論

紅球菌R04,是需氧的革蘭氏陽性細菌,和分枝桿菌同屬于放線菌[13]。大腸桿菌作為外源基因表達的宿主,遺傳背景清楚,技術(shù)操作簡單,培養(yǎng)條件簡單。為了構(gòu)建高純度的RHOGL008438重組蛋白分離純化體系,探討其生理功能,本研究利用大腸桿菌BL21 異源表達紅球菌R04 RHOGL008438重組蛋白[14]。融合表達質(zhì)粒pET-21a-DP轉(zhuǎn)入大腸桿菌細胞中誘導表達后,大腸桿菌細胞形態(tài)異常,細胞出現(xiàn)絲狀化,隨著IPTG誘導濃度的加大,絲狀化程度增大,表明RHOGL008438蛋白的過量表達干擾了大腸桿菌細胞隔膜的形成,對宿主大腸桿菌的細胞分裂造成了影響,引起細胞絲狀化。研究報道,將牙齦卟啉單胞菌的FtsZ蛋白在大腸桿菌中過表達后導致了大腸桿菌細胞絲狀化[8],細胞伸長約20倍,說明牙齦卟啉單胞菌的FtsZ蛋白可以干擾大腸桿菌細胞隔膜的形成,這與本研究的結(jié)果一致,表明RHOGL008438蛋白為細胞分裂相關(guān)蛋白,其生理功能與隔膜形成有關(guān)。

有關(guān)大腸桿菌細胞絲狀化的研究報道主要集中在對FtsZ蛋白的抑制方面。當FtsZ的GTP酶活性受到阻礙時對其FtsZ濃度會造成一定的影響,FtsZ的濃度影響細胞分裂的進行[15]。有報道指出多環(huán)生物堿中的血根堿通過減少FtsZ的聚合來抑制FtsZ原絲組裝,進而抑制FtsZ蛋白[16]。生物堿中的小檗堿也可通過抑制GTP酶活性和降低FtsZ聚合抑制FtsZ蛋白[17]。在一些革蘭氏陰性菌中存在抑制FtsZ蛋白的SOS途徑,SulA蛋白參與SOS途徑,以1∶1的比例結(jié)合FtsZ單體,以減少FtsZ在細胞內(nèi)的有效濃度,通過抑制FtsZ在分裂位點的聚合從而引起細胞絲狀化[18-19]。RHOGL008438蛋白過表達阻礙宿主大腸桿菌的細胞分裂而形成絲狀化菌體這一過程的機制需要進一步研究。

本研究通過將RHOGL008438蛋白在大腸桿菌BL21細胞中誘導表達后觀察其對大腸桿菌細胞分裂的影響,證實RHOGL008438為細胞分裂相關(guān)基因,該基因功能與隔膜形成有關(guān),這為進一步研究紅球菌R04細胞的分裂提供依據(jù),為研究FtsZ蛋白作為抗菌藥物的新靶點提供基礎。

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Effect ofRhodococcussp. R04 Cell-division-related Protein RHOGL008438 on the Filaments Formation ofEscherichiacoli

XU Xiaoxiao,YANG Xiuqing*

(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education,Institute of biotechnology,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

Transcriptomics analysis indicated that the protein RHOGL008438 ofRhodococcussp. R04 may be related to cell division. The heterologous expression of RHOGL008438 inEscherichiacoliBL21 was performed to find out its physiological function on cellular morphology by fluorescence microscope.The results showed that the filamentous cells were formed. There was a significant correlation between cell filamentous and IPTG concentration. The longer the culture time was, the longer the filamentous was. The cell length ofE.coliwas reached 46.2 μm after 5 h under 0.5 mmol/L IPTG. The results revealed that RHOGL008438 inhibited the formation of septum ofE.coli, and confirmed it played a significant role in cell division. RHOGL008438 was then identified as cell-division-related protein FtsZ by sequence homology analysis.Key words：Rhodococcussp. R04;cell division protein;bacterial cell division;heterologous expression

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.02.027

2017-03-01；

2017-03-09

山西省自然科學基金(2014011030-3);山西省煤層氣聯(lián)合研究基金(2015012002);山西省煤基重點科技攻關(guān)項目(MQ2014-03)

許曉瀟(1992-),女,碩士研究生,研究方向為微生物生物轉(zhuǎn)化與生物催化。

*通信作者：楊秀清(YANG Xiuqing),E-mail:xiuqyang@sxu.edu.cn

Q93;Q25

A

0253-2395(2017)02-0373-07