水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物檢測結(jié)果不確定度的評定

馬瑞欣　王曉靜　周凡　王國輝

摘 要：采用液相色譜--串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物的殘留量。對影響檢測結(jié)果的各分量不確定度進行了分析，最終得到檢測結(jié)果在置信水平約95%、包含因子k=2時的擴展不確定度。結(jié)果表明，測量重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線是影響樣品中AOZ殘留量結(jié)果的主要因素。

關(guān)鍵詞：呋喃唑酮代謝物（AOZ）；液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜法；不確定度

不確定度是指由于測量誤差的存在，對被測量值不能肯定的程度。它是檢測結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)。不確定度越小，檢測結(jié)果與被測量的真值越接近，檢測結(jié)果質(zhì)量越高；不確定度越大，檢測結(jié)果質(zhì)量越低。JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》中測量不確定度的定義為：表征合理地賦予被測量之值的分散性，與檢測結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[1]?！稒z驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則》4.5.15條規(guī)定“檢驗檢測機構(gòu)應(yīng)根據(jù)需要建立和保持應(yīng)用評定測量不確定度的程序”。

本文參考農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006[2]檢測方法，對呋喃唑酮代謝物（AOZ）殘留量測定結(jié)果的不確定度來源進行了分析和評定，最終得到檢測結(jié)果在置信水平約95%、包含因子k=2時的擴展不確定度。

1 方法原理及步驟

1.1 稱量

稱取樣品2.0 g（精確到0.01 g）于離心管中。

1.2 水解和衍生化

加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液渦旋混勻50 s，再加入5 mL鹽酸溶液和0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋振蕩50 s，置于恒溫水浴振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。

1.3 提取凈化

取出離心管冷卻至室溫，加入3～5 mL 磷酸氫二鉀溶液，調(diào)節(jié)pH=7.0～7.5，加入4 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩50 s，離心，取上清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中；再加入4 mL乙酸乙酯重復(fù)上述操作，合并上清液于40 ℃下氮氣吹干。準(zhǔn)確加入1.0 mL水渦旋振蕩溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作

取10 ng/mL AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液0.025 mL、0050 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 于8個離心試管中，操作步驟同1.2和1.3。

1.5 定量測定結(jié)果

以AOZ定量離子響應(yīng)面積As與內(nèi)標(biāo)定量離子響應(yīng)面積Ai之比對濃度做工作曲線，曲線強制過原點。樣品制備液中AOZ的濃度由儀器工作站按標(biāo)準(zhǔn)工作曲線給出。

1.6 樣品中AOZ殘留量按下式計算：

2 不確定度評定

2.1 影響檢測結(jié)果的過程描述

2.1.1 AOZ標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制 稱取 10.0 mg AOZ，用甲醇定容至50 mL，濃度為200 μg/mL。AOZ純度為 99.6±0.3%。所用儀器和器皿：十萬分之一電子天平（兩次稱量相減）、50 mL容量瓶。

2.1.2 AOZ中間液的制備 取儲備液50 μL用水稀釋至100 mL，濃度為100 ng/mL，取5 mL該溶液，用水稀釋至50 mL，濃度為10 ng/mL。所用儀器和器皿：100 μL移液槍、5 mL移液管、50 mL容量瓶、100 mL容量瓶。

稱取樣品2.00 g，加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液。 所用儀器：百分之一電子天平（兩次稱量相減）、100 μL移液槍。

氮吹濃縮至干后用水定容至1.0 mL。所用儀器：1.0 mL移液槍。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線取8個點衍生同上，最后用水定容至1.0 mL，每個濃度點只進樣一次，以AOZ定量離子響應(yīng)面積As與內(nèi)標(biāo)定量離子面積Ai之比對濃度做工作曲線，曲線強制過原點。所用儀器：1.0 mL移液槍。

測定儀器：AB SCIEX QTRAP4500 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀。

2.2 各分量標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

2.2.1 檢測重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1

獨立檢測3份樣品，所得結(jié)果為：2.24 μg/kg，2.28 μg/kg，2.44 μg/kg，平均值為2.32 μg/kg。

單次檢測的實驗標(biāo)準(zhǔn)差計算公式為：

日常分析中，檢測兩份平行樣品，報告平均值。兩次檢測結(jié)果平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u1rel=S（X）2X=0.1061.414×2.32=0.032 3

此分量（A類不確定度）綜合體現(xiàn)了檢測方法、測定儀器、體積與質(zhì)量測量中各個方面的隨機效應(yīng)。因此，在隨后評定其他分量時不需要再考慮隨機效應(yīng)了。

2.2.2 ci的不確定度u2

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2（1）

因強制過原點，標(biāo)準(zhǔn)曲線9個點，結(jié)果見表1：

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線一次性方程為： y=0·121 63x，r=0.999 39

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度計算公式[3]為：

u2（1）=S（cp）=S（f）b1p+1n+（f-f）2b2∑ni=1（Ci-C）2

式中：p—樣品平行測定的次數(shù)；n—擬合直線的點數(shù)；b—擬合直線的斜率，b=0.121 63；

cp—試樣測試值；c—繪制擬合直線輸入值Ci（n個）的平均值。

本實驗中：n=9 ， p=2，2個平行樣品中AOZ定量離子面積分別為y1=155 019，y2=147 926；內(nèi)標(biāo)定量離子面積分別為y內(nèi)1=537 903，y內(nèi)2=539 252。f1=155 019537 903=0.288 2，f2=147 926539 252=0.274 3，標(biāo)準(zhǔn)偏差s（f）=0.009 829。利用擬合直線得到2個平行樣品上機溶液的對應(yīng)濃度為2.369 ng/mL和2.255 ng/mL，平均值2312 ng/mL，樣品上機溶液的濃度通過擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線確定，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度為：

2.2.2.2 內(nèi)標(biāo)體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2（2）

查檢定證書得知：100 μL移液槍在100 μL檢定點的誤差為2.0 μL，區(qū)間半寬度為1.0 μL，服從三角分布，包含因子k=6，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：1.0 μL/k=6=0.41 μL。實驗在20 ℃下進行，實驗室溫度介于±5 ℃之間，水的體積膨脹系數(shù)為 2.07×10-3 / ℃，服從均勻分布，區(qū)間半寬度為 5 ℃×2.07×10-3 ℃-1=1.04×10-2，包含因子k=3，由溫度變動引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.04×10 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u2（2）=0.412+0.00 602=0.41（μL）

相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u2（2）rel=0.41100=0004 1

樣品制備液中AOZ濃度的相對不確定度是上述分量的合并，即：

u2rel=u22（1）rel+u22（2）rel =0.028 02+0.004 12=0.028 3

2.2.3 AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3

2.2.3.1 AOZ儲備溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

a.AOZ質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3（1）

十萬分之一電子天平的最大允差為±0.01 mg，服從均勻分布，區(qū)間半寬度為0.01 mg，由此項引入的不確定度為0.01 mg/3=0.005 77 mg

天平分辨力為0.01 mg， 服從均勻分布，區(qū)間半寬度為0.005 mg，引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0005 mg/3=0.002 89 mg

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（m）=0.005 772+0.002 892=0.006 45（mg）；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0 mg是通過兩次稱量相減得到，故u3（1）rel=2×0.006 4510.00=0.000 912

b.50 mL容量瓶體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3（2）

50 mL A級容量瓶在20 ℃的體積為50 mL±0.05 mL，假設(shè)為三角分布，區(qū)間半寬度0.05 mL，由此項引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.05 mL/6=0.020 4 mL

容量瓶在20 ℃校準(zhǔn)，實驗室溫度在（20±5） ℃之間，液體的膨脹體積明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需考慮液體體積膨脹。甲醇的膨脹系數(shù)為0.001 20 ℃-1，由此項引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為5×0.001 203=0.03 46（mL）

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u3（2）=0.020 42+0.003 462=0.020 7（mL），相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u3（2）rel=0.020 7/50=0000 414

c.AOZ純度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3（3）

AOZ純度 99.6±0.3%，區(qū)間半寬度為03%，服從正態(tài)分布，包含因子k=1.96，由此項引入的不確定度u3（2）rel=0.003/1.96=0.001 5，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u3（2）rel=0.001 5/0.996=0.001 5

2.2.3.2 中間稀釋液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

a.移液槍引入的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3（4）

100 μL移液槍在50 μL檢定點的誤差為1.5 μL，區(qū)間半寬度為0.75 μL，假設(shè)為三角分布，包含因子k=6。因此，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.75 μL/6=0.306 μL。

甲醇的膨脹系數(shù)為0.001 20 ℃-1，由此項引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：5×0.001 203=0.003 46（μL）

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u3（4）=0.3062+0.003 462=0.306（μL），相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u3（4）rel=0.306/50=0.006 12

b.50 mL容量瓶引入的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3（5）

50 mL A級容量瓶在20 ℃的體積為50 mL±0.05 mL，假設(shè)為三角分布，區(qū)間半寬度0.05 mL，由此項引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.02 mL/6=0.020 4 mL

由2.2.2.2知因水的體積受溫度的變動引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 0.006 0 mL。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u3（5）=0.02 042+0.006 002=0.021 3（mL），相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u3（5）=0.021 3/50=0000 426

c.吸量管引入的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3（6）

據(jù)JJG196-2006中規(guī)定，5 mLA級分度吸量管的允差為±0.025 mL，符合三角分布，區(qū)間半寬度為0.025 mL，由此項引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.025 mL/6=0.010 2 mL

由2.2.2.2知因水的體積受溫度的變動引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 0.006 0 mL。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3（6）=0.010 22+0.006 002=0.011 8（mL），相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u3（6）rel=0.011 8/5.00=0002 36

d.100 mL容量瓶引入的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3（7）

100 mL A級容量瓶的允差為±0.10 mL，假設(shè)為三角分布，區(qū)間半寬度為0.10 mL，由此項引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.10 mL/6=0.040 8 mL

由2.2.2.2知因水的體積受溫度的變動引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.006 0 mL。合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3（7）=0.040 82+0.006 02=0.041 2（mL），相對合成不確定度為：u3（7）rel=0.041 因此標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制和稀釋過程中引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 ：

2.2.4 試樣質(zhì)量m稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u4

天平檢定合格，天平說明書中標(biāo)明允差為±0.01 g，服從均勻分布，區(qū)間半寬度為0.01 g，包含因子k=3，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.01 g/3=005 8 g

天平說明書中標(biāo)明其分辨力為0.01 g，服從均勻分布，區(qū)間半寬度為0.005 g， 包含因子k=3，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.00 5 g/3=0.002 9 g

m稱量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u4=0.005 82+0.002 92=0.006 48 g

稱取樣品2.00 g，通過2次稱量相減獲得，m的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 試樣體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u5

檢定證書上1 mL移液槍的誤差為0.001 mL，區(qū)間半寬度為0.000 5 mL，服從三角分布，包含因子k=6，因此，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.000 5 mL/6=0.000 204 mL

由2.2.2.2知因水的體積受溫度的變動引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.006 0 mL。

試樣體積V的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u5=0.000 2042+0.006 02=0.006 01（mL）

定容體積為1.000 mL，試樣體積V的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u3rel=0.006 011.000=0.006 00

2.2.6 回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u6

取9份空白樣品2.00 g ，分別加入4.00 ng標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)量為2.00 μg/kg，按上述方法測定，測定結(jié)果見表2。

回收率的平均值R=19∑9i=1Ri=100，標(biāo)準(zhǔn)偏差SR=∑9i=1（R-R）n-1=3.23，回收率的相對不確定度u6rel=SRRn=3.23100×9 =0.010 7

采用t檢驗法對回收率進行顯著性檢驗，t=100-Ru（R）=100-1003.23/9=0，查表t0.95（8）=231，t

2.3 計算AOZ檢測結(jié)果的不確定度

2.3.1 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.2 擴展不確定度 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（X）=1.16 μg/kg×0.045 4=0.052 7 μg/kg。95%概率下取包含因子k=2，則擴展不確定度為U=2×0.052 7 μg/kg=0.11 μg/kg。

2.3.3 檢測結(jié)果表示 樣品中AOZ殘留量的結(jié)果表示為（1.16±0.11） μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

通過對各分量不確定度的評估可以看出：測量重復(fù)性不確定度和工作曲線引入的不確定度是影響樣品中AOZ殘留量檢測結(jié)果不確定度的主要因素。提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性可以通過優(yōu)化穩(wěn)定儀器工作狀態(tài)和準(zhǔn)確配制標(biāo)準(zhǔn)系列來實現(xiàn)。本評定報告可對提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確度起到指導(dǎo)作用。

參考文獻：

[1]

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJF1059.1-2012測量不確定度評定與表示[S].中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013

[2] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].中國農(nóng)業(yè)出版社出版，2006

[3] 周尊英，劉心同，實驗室質(zhì)量管理統(tǒng)計技術(shù)[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014：256.

（收稿日期：2016-11-21）