李銘

[摘要] 目的 建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量的方法。 方法 色譜條件采用Agilent SB-C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈-0.2%冰乙酸（70︰30）為流動相，流速為0.3 ml/min。質(zhì)譜檢測采用正離子電噴霧離子源（ESI+），在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下檢測，監(jiān)測離子（m/z）分別為：144/58、144/84。 結(jié)果 鹽酸水蘇堿濃度在0.2～10.0 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9992），平均回收率為102.6%，RSD為1.5%（n=6）。 結(jié)論 該方法快速簡便、專屬性強、結(jié)果準確，可用于益母草顆粒的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 益母草顆粒；鹽酸水蘇堿；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）01（b）-0008-03

Content of stachydrine hydrochloride from Motherwort granule determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LI Ming

Institute for Food and Drug Control of Beihai in the Guangxi Zhuang Autonomous Region，Beihai 536000，China

[Abstract] Objective To establish a method of high performance liquid chromatography （HPLC）-tandem mass spectrometry determining the content of stachydrine hydrochloride from Motherwort granule. Methods The chromatographic conditions were Agilent SB-C18 column （50 mm×2.1 mm，1.8 μm），acetonitrile to 0.2% glacial acetic acid （70︰30） as the mobile phase，and a flow rate of 0.3 ml/min.Positive ion electrospray ionization（ESI+） was applied for mass spectrometric detection under multiple reaction monitoring（MRM） mode.The monitored ions （m/z） was 144/58，144/84 respectively. Results The concentration of stachydrine hydrochloride being within 0.2 μg/ml to 10.0 μg/ml had a good linear relationship with the peak area.The r value was 0.9992，and the average recovery was 102.6% and the value of RSD was 1.5%（n=6）. Conclusion The method is fast，simple，specific，and accurate in outcome，which can be used for quality control of Motherwort granule.

[Key words] Motherwort granule；Stachydrine hydrochloride；High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

益母草顆粒是由益母草水提取物為主要原料加蔗糖、糊精等輔料經(jīng)適當(dāng)加工而成的婦科常用中成藥，具有活血調(diào)經(jīng)止痛等功能，臨床上用于治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀血腹痛及產(chǎn)后惡露不絕、經(jīng)量少、淋漓不凈、產(chǎn)后出血時間過長、產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全等。益母草中的主要活性成分為鹽酸水蘇堿。益母草顆粒為《中國藥典》2010年版一部收載品種[1]，其對益母草中的鹽酸水蘇堿含量測定采用薄層色譜掃描。該方法影響因素多，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差。部分文獻[2-20]采用高效液相色譜法，選用紫外檢測器[2-14]、蒸發(fā)光檢測器[15-19]、示差折光檢測器[20]測定益母草制劑中鹽酸水蘇堿的含量。其大多數(shù)使用較特別的色譜柱，如氨基色譜柱、磺酸基陽離子交換色譜柱、丙烯酰胺色譜柱，且樣品提取過程復(fù)雜，操作不簡便。本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，利用質(zhì)譜較高的選擇性和專一性，只用普通的C18反相色譜柱，只需簡單的超聲提取即能完成對益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量的測定，而該方法國內(nèi)文獻未被報道過。測定結(jié)果表明，該方法操作簡便、專屬性強、靈敏度高、結(jié)果準確可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試劑

美國Agilent 1290高效液相色譜儀，Agilent 6460三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜；AX205DU電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SK250超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)儀器有限公司，250 W，35 kHz）。

鹽酸水蘇堿對照品（中國食品藥品檢定研究所，含量：99.0%，批號：110712-201010）供含量測定用；益母草顆粒（A廠：批號130304；B廠：批號140402；C廠：批號130402），為市售品；乙腈為色譜純，水為市售娃哈哈純凈水，冰乙酸為優(yōu)級純，其余檢測用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18柱（50 mm×2.1 mm）；流動相為乙腈-0.2%冰乙酸（70︰30）；流速為0.3 ml/min；柱溫為30℃；進樣量為5 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為大氣壓電噴霧離子源（ESI源），選擇掃描方式為正離子，采用全掃描、選擇離子掃描及二級全掃描；霧化氣壓力：30 Psi（1 Psi=6890 Pa），干燥氣溫度：300℃，輔助氣（N2）流速：8.0 L/min，離子源Vcap毛細管電壓：4000 V，含量測定監(jiān)測方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），鹽酸水蘇堿定性離子質(zhì)荷比（m/z）144/84，定量離子質(zhì)荷比144/58；定性和定量離子對應(yīng)的碰撞能量壓分別為22、26 V，碎裂電壓均為128 V。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸水蘇堿對照品12.55 mg，置25 ml量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.497 mg/ml對照品貯備溶液。精密量取對照品貯備液1 ml，置25 ml量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為19.9 μg/ml的對照品使用溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品5包顆粒內(nèi)容物，研細混勻，稱取約5 g重量，精密稱定，置50 ml量瓶中，加70%乙醇約40 ml，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）20 min，取出放冷至室溫，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻、過濾，精密量取續(xù)濾液2 ml置100 ml量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按藥品標準中的處方比例和制法制備不含益母草的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法操作制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性考察試驗

精密量取上述對照品使用溶液，供試品溶液，陰性對照溶液各5 μl注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，按上述色譜及質(zhì)譜條件下測定，記錄色譜圖，結(jié)果鹽酸水蘇堿的保留時間約為3.5 min，溶液內(nèi)的其他雜質(zhì)不干擾樣品中的鹽酸水蘇堿分離測定，陰性樣品在鹽酸水蘇堿色譜峰相應(yīng)的保留時間處未見干擾峰出現(xiàn)，表明方法的專屬性良好（圖1）。

2.4 線性關(guān)系考察試驗

精密量取上述對照品使用溶液0.1、0.5、1、2、5 ml分別置10 ml容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，即得一系列濃度的標準曲線對照品液。取每個濃度的標準曲線對照品液各5 μl分別注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，記錄峰面積，進行線性考察。以濃度（X）對峰面積（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y=31.96X+3.94×103（r=0.9992）。結(jié)果表明，鹽酸水蘇堿在0.2～10.0 μg/ml的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性試驗

取同一批號樣品（批號：130304）共6份，按供試品溶液的制備方法平行配制6份供試品溶液，同法測定，測得平均含量為6.0265 mg/g，RSD為1.67%，表明方法有較好的重復(fù)性。

2.6 精密度試驗

取鹽酸水蘇堿對照品使用溶液5 μl，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣5次，結(jié)果峰面積的RSD為0.77%，表明分析方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一份供試品溶液5 μl，分別在0、2、4、6、8、10、12、16、20 h按上述色譜條件下進行測定，結(jié)果鹽酸水蘇堿峰面積RSD為1.1%，表明在20 h內(nèi)供試品溶液中鹽酸水蘇堿峰面積無明顯變化，供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取同一批號（批號：130304）的已知含量樣品5包，取顆粒研細混勻，稱取6份約2.5 g細粉，精密稱定，分別置50 ml量瓶中，分別精密加入鹽酸水蘇堿對照品適量，分別加70%乙醇約40 ml，超聲處理20 min，取出放冷，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻、過濾，分別取續(xù)濾液2.00 ml，用70%乙醇定容至100 ml量瓶，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為回收率測定的供試品溶液。再按上述色譜及質(zhì)譜條件下進樣，測定鹽酸水蘇堿峰面積，按標準曲線測得含量，計算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為102.6%，RSD為1.5%（表1）。

表1 加樣回收率試驗測定結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測定

取不同生產(chǎn)廠家樣品3批，按上述供試品溶液的制備方法配制供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，代入線性方程計算含量。3個廠家3個批號樣品含量測定結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 提取時間的選擇

在供試品溶液的制備上，本實驗通過對不同超聲的提取時間（10、20、30、40 min）進行考察，結(jié)果顯示，超聲提取20 min已將樣品中的鹽酸水蘇堿提取完全。

3.2 流動相比例的選擇

在流動相的選擇上，流動相中乙腈與0.2%冰乙酸的比例經(jīng)過多次配比試驗，當(dāng)乙腈︰0.2%冰乙酸=70︰30時樣品中的其他成分對鹽酸水蘇堿的測定無干擾，且鹽酸水蘇堿的出峰時間適當(dāng)，峰形、理論塔板數(shù)均較理想，故選用該比例進行測定。

3.3 質(zhì)譜條件的選擇

在對質(zhì)譜條件的優(yōu)化考察中，為使鹽酸水蘇堿的各子離子峰信號達到最強，以正、負離子模式分別進行檢測，進行二級質(zhì)譜掃描并通過優(yōu)化裂解電壓以及碰撞能壓，經(jīng)多次實驗達到最佳的質(zhì)譜條件。

3.4 本實驗方法的優(yōu)點

益母草顆粒的原質(zhì)量標準中的含量測定采用薄層色譜掃描法測定，其處理較為繁瑣，測定時間長，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差，而高效液相色譜法，色譜柱選擇要求條件高，樣品提取過程復(fù)雜，部分方法采用檢測器靈敏度低。本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含量，具有較高的選擇性和專一性，靈敏度高，色譜柱選擇較普通常用，操作簡便、重復(fù)性好。

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（收稿日期：2015-06-09 本文編輯：王紅雙）