韋祖生 楊秀娟 田益農(nóng)

摘要[目的]通過研究建立木薯主栽品種的再生體系，獲得更多的優(yōu)質研究材料。 [方法]根據(jù)細胞全能性理論，以木薯幼葉、腋芽為材料，優(yōu)化培養(yǎng)基組分，誘導木薯體細胞發(fā)生、分化，器官等發(fā)育，培養(yǎng)再生株系。[結果] 不同品種材料間的再生能力總體表現(xiàn)由大到小為：GR3、SC205、GR9891、GR911；腋芽誘導體細胞胚性愈傷組織的效果明顯優(yōu)于幼葉；IBA 誘導木薯體細胞胚發(fā)生效果優(yōu)于6-BA，且二者間具有互作作用；IBA 與NAA 激素組合對誘導木薯不定芽生根效果優(yōu)于單一使用效果。[結論] 建立了4個木薯主栽品種（SC205、GR891、GR911和GR3）高效的再生體系，為木薯種質保護、創(chuàng)新利用研究提供技術基礎。

關鍵詞木薯；幼葉；腋芽；體細胞胚；再生

中圖分類號S533文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）35-0009-04

Abstract[Objective] The aim was to obtain more highquality research materials by constructed regeneration system of cassava cultivars. [Method] According to the cell totipotency， with young leaves and axillary buds as materials， we optimized the medium composition， induced the somatic embryogenesis and differentiation， as well as organ development， and cultivated regeneration lines. [Result] The regeneration abilities for four cultivars were in the order of GR3， SC205， GR9891， GR911；the axillary buds were better than young leaves to induce somatic embryonic callus；IBA had much better effect to induce the formation of cassava somatic embryo than 6BA， and they showed synergistic effect；The combination of IBA and NAA had better effect to induce the rooting of adventitious buds than using only one. [Conclusion] Efficient regeneration systems for four main cassava cultivars （SC205， GR891， GR911 and GR3） were established， which provided technical basis for protection and innovation of cassava germplasm.

Key wordsCassava；Young leaf；Axillary bud；Somatic embryo；Regeneration

木薯（Manihot esculenta crantz）原產(chǎn)于南美洲亞馬遜流域，由于其淀粉產(chǎn)量高、用途廣、種植生產(chǎn)管理條件要求不高等原因，是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的糧食和經(jīng)濟作物 [1-3]。隨著中國工業(yè)的高速發(fā)展，每年都需進口大量木薯干片和淀粉[4]。因此，發(fā)展木薯優(yōu)良品種培育和節(jié)約化栽培技術，可打破制約木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。分子育種技術在提高木薯淀粉產(chǎn)量、改良淀粉品質、提高逆境抗性等方面具有比傳統(tǒng)育種方式更大的優(yōu)勢。但要運用分子育種技術進行木薯遺傳改良，先決條件是要建立起體細胞再生及遺傳轉化體系。已有相關報道建立了TMS60444脆性胚性愈傷、次生胚狀體子葉、葉盤法以及次生胚狀體等再生轉化體系[5-7]，而針對種植生產(chǎn)主要品種的再生轉化體系研究相對缺乏[8]。筆者選擇了目前種植生產(chǎn)上應用廣泛的4個栽培品種（SC205、GR891、GR911和GR3）為研究對象，通過外植體選擇、培養(yǎng)基優(yōu)化等建立起這4種主要栽培品種的再生體系，為建立木薯遺傳轉化（改良）體系提供技術基礎。

1材料與方法

1.1材料

選用的4個主要栽培木薯品種為SC205、GR891、GR911和GR3，均由廣西亞熱帶作物研究所提供。

參考Zhang 等[7]研究結果，改良了如下6種培養(yǎng)基：① M1（ MS+2 μmol/L CuSO4+ 2.0% 蔗糖+0.3% Gelrite，pH 6.0）；② M2（M1+12.0 mg/L 6-BA）；③ M3（M1+毒莠定，或2，4-D）；④ M4（M1+ 6-BA，或IBA，或6-BA+ IBA）；⑤ M5（M1+0.15 mg/L 6-BA）；⑥ M6（M1+ IBA，或NAA，或IBA+NAA）。

1.2方法

1.2.1制備無菌苗。

取木薯嫩枝，用酒精、升汞除菌后在M1培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，獲得無菌苗，在M1培養(yǎng)基上繼代、擴繁，備用。

1.2.2誘導外植體膨大。

從培養(yǎng)28 d的無菌苗上切取1.0～1.5 cm帶腋芽的莖段或者不超過6.0 mm的幼葉，水平放置在M2培養(yǎng)基上，30個外植體/皿，10皿/品種，26.0 ℃，16.0 h（800～1 000 Lx）光照，膨大培養(yǎng)3～7 d，觀察并記錄。

1.2.3誘導胚性愈傷組織的發(fā)生、分化。

選用2，4-D及毒莠定為誘導激素，2，4-D及毒莠定均設置6.0、12.0、14.0及18.0 mg/L共4個濃度梯度，分別添加在M1培養(yǎng)基上，獲得誘導培養(yǎng)基M3。挑取膨大腋芽（約1.0 mm）或者從莖尖1.0～2.0 mm幼葉轉移到M3，30個/皿，5皿/處理；26.0 ℃暗培養(yǎng)。每2 d在體視顯微鏡下觀察胚性愈傷的發(fā)生情況，第4天開始統(tǒng)計初生胚的數(shù)量，計算出胚率。當球型或魚雷型胚出現(xiàn)時，立即轉移、繼代到新鮮M3培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2.4誘導體細胞胚的分化、成熟。

將初生胚狀體分離、轉移到M4培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，誘導次生胚狀體分化、增殖，每14 d繼代1次，建立循環(huán)培養(yǎng)，觀察并統(tǒng)計增殖速率。

將4～5個體細胞胚組成愈傷簇放置于M5培養(yǎng)基，26.0 ℃光照培養(yǎng)（800～1 000 Lx）16.0 h，每4 d觀察1次，直至子葉明顯膨大、變綠，于第8天統(tǒng)計成熟度。取12、16 d的成熟胚，轉移到M6培養(yǎng)基上誘導萌發(fā)、生根，第25、30天后統(tǒng)計生根苗數(shù)。

1.2.5子葉誘導次生體細胞胚胎、芽器官發(fā)生以及子葉成熟與萌發(fā)。

取12 、16 d的成熟子葉切片（約0.25 cm2），置于M3培養(yǎng)基上，30個/皿，5皿/品種，26.0 ℃暗培養(yǎng)，每3 d觀察次生胚狀體的發(fā)生情況，15 d后統(tǒng)計出胚率。

將成熟子葉切片（約0.25 cm2），置于M6培養(yǎng)基上，30個/皿，5皿/品種，26.0 ℃暗培養(yǎng)，每3 d在體視顯微鏡下觀察次生胚狀體的發(fā)生情況。21 d后統(tǒng)計不定芽誘導情況。

將芽原基及再生不定芽發(fā)育成熟材料轉移至M6培養(yǎng)基，26.0 ℃光照培養(yǎng)（800～1 000 Lx）16.0 h，每4 d觀察1次，直至長成幼苗，第12、16天統(tǒng)計生根苗數(shù)。

1.2.6不定芽生根與移栽。

將離體再生株系轉移到M1培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)。21 d后，將生根良好、健壯材料進行開瓶、煉苗后取出，用清水洗凈附著在根系上的培養(yǎng)基，盡量避免不定根的斷裂，然后移栽到培養(yǎng)基質營養(yǎng)杯中；放置于溫室中培養(yǎng)、觀察，并注意定時通風換氣、保溫、保濕；21 d后，再生株系可進行大棚移栽。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel和 SAS 9.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析[12]。

2結果與分析

2.12，4-D及毒莠定對4個木薯品種幼葉誘導胚性愈傷的影響

由表1可知，2，4-D和毒莠定對4個木薯品種的幼葉誘導胚性愈傷均有積極效應。在相同的誘導條件下，GR3的幼葉誘導胚性愈傷數(shù)量極顯著多于SC205、GR891和GR911，而其他3個品種間的差異性不顯著，胚性愈傷誘導力從大到小依次為GR3、SC205、GR891、GR911；相同木薯品種在不同激素水平誘導條件下，2，4-D濃度為12.0和14.0 mg/L時，幼葉誘導胚性愈傷數(shù)量多于6.0和18.0 mg/L，呈顯著性差異；毒莠定濃度為12.0和14.0 mg/L時，幼葉誘導胚性愈傷數(shù)量大于6.0和18.0 mg/L，呈顯著性差異。除GR911在2，4-D為14.0 mg/L時誘導效果好于12.0 mg/L外，其余3個品種均在2，4-D為12.0 mg/L時誘導效果最好。4個木薯品種的毒莠定為12.0 mg/L時，誘導效果最好。綜合2種生長調節(jié)劑不同濃度的結果可知，木薯品種間基因型對誘導胚性愈傷能力具有差異性。

2.22，4-D及毒莠定對4個木薯品種腋芽誘導胚性愈傷的影響

由表2可知，2，4-D和毒莠定對4種木薯栽培品種的腋芽均可誘導胚性愈傷。不同木薯品種在相同的誘導條件下，GR3的腋芽誘導胚性愈傷數(shù)量顯著多于SC205、GR891和GR911，其他3個品種間的差異性不顯著，胚性愈傷誘導力從大到小依次為GR3、SC205、GR891、GR911；在不同激素水平誘導條件下，2，4-D濃度為12.0和14.0 mg/L時腋芽誘導胚性愈傷數(shù)量多于6.0和18.0 mg/L，差異性顯著；相同木薯品種在不同激素水平誘導條件下，2，4-D濃度為12.0和14.0 mg/L時腋芽誘導胚性愈傷數(shù)量分別高于6.0和18.0 mg/L，差異性顯著。2，4-D和毒莠定在12.0和14.0 mg/L時對4個品種的誘導效果均明顯好于6.0和18.0 mg/L，4個品種均在毒莠定、2，4-D為12.0 mg/L時，誘導效果最好。2種生長調節(jié)劑不同濃度的試驗結果顯示，木薯品種間誘導胚性愈傷能力有較大差異，可以分為2組：GR3和SC205；GR891和GR911。前一組的誘導效果要明顯好于后一組。

2.3不同植物生長調節(jié)劑組合對4種木薯品種胚性愈傷分化的影響

由表3可知，同一木薯品種在不同激素組合的誘導條件下，IBA+6-BA誘導胚性愈傷分化數(shù)量顯著多于IBA、6-BA；其中IBA、6-BA間的差異不顯著，誘導優(yōu)越性排序從大到小依次為IBA+6-BA、IBA、6-BA；IBA濃度為1.5和2.0 mg/L時，誘導胚性愈傷分化數(shù)量顯著多于1.0 mg/L；6-BA濃度為0.8 mg/L時，誘導胚性愈傷分化數(shù)量顯著多于0.4和1.2 mg/L；IBA+6-BA濃度為（1.5+08） mg/L時，誘導胚性愈傷分化數(shù)量顯著多于（1.5+0.4） mg/L和（1.0+0.4）mg/L。

IBA和6-BA單一均能誘導木薯的胚性愈傷發(fā)生不同程度的分化，而二者混合使用誘導時效果明顯提高，說明2種激素間具有一定程度的協(xié)同作用。IBA 1.5 mg/L+6-BA 0.8 mg/L的組合對木薯胚性愈傷的誘導分化效果最好。從品種間響應來看，GR3（73.2%）略優(yōu)于SC205（70.4%），但均明顯優(yōu)于GR911（60.2%），GR891（50.8%）最差，說明不同品種間呈顯著性差異。

2.4不同植物生長調節(jié)劑組合對4個木薯品種不定芽誘導生根的影響

由表4可知，同一木薯品種在不同激素的誘導條件下，1/2IBA+1/2NAA處理不定芽誘導生根均優(yōu)于IBA和NAA，呈顯著性差異，而其IBA和NAA間的差異性不顯著，誘導能力從大到小依次為1/2IBA+1/2NAA、IBA、NAA；IBA濃度為1.00和1.50 mg/L時，誘導不定芽和生根均優(yōu)于1.00 mg/L，呈顯著性差異；NAA濃度為1.00和1.50 mg/L時，誘導不定芽、生根均優(yōu)于1.00 mg/L，呈顯著性差異；當1/2IBA+1/2NAA mg/L濃度為（0.50+0.50） mg/L和（0.75+0.75） mg/L時誘導不定芽、生根均優(yōu)于（0.25+0.25） mg/L，呈顯著性差異。

IBA和NAA均能誘導木薯再生組織不定芽生根，而二者的混合使用效果明顯優(yōu)于單一使用效果，說明2種激素之間具有一定程度的協(xié)同作用。除GR891在IBA 1.5 mg/L時達到最大生根率14.1%，其余3個品種均在IBA 1.00 mg/L達到最大生根率；4個品種均在NAA 1.00 mg/L 時達最大生根率；除GR911在IBA 0.75 mg/L +NAA 0.75 mg/L達到最大生根率18.5%外，其余3個品種均在IBA 0.50 mg/L +NAA 0.50 mg/L達最大生根率；不同木薯品種分析顯示，GR3與SC205最好，其次是GR891，而GR911最差。

2.5木薯主栽品種腋芽、幼葉高效再生體系的建立與優(yōu)化

從圖1可以看出，木薯主栽品種均可以腋芽（A）、幼葉（B）為外植體，誘導獲得胚性愈傷（C），通過胚性愈傷的成熟（D）、分化（E），獲得體細胞胚（F），體細胞胚進一步成熟，獲得帶子葉的體細胞胚（G），或者誘導體細胞胚分化獲得不定芽（H），將不定芽剪下誘導生根（I），煉苗后移入大棚栽培。

3討論

相關研究結果[5-7]顯示，以4個木薯主栽品種SC205、GR3、GR891和GR911的腋芽、幼葉為外植體，通過誘導、培養(yǎng)激素水平的優(yōu)化，建立了體細胞胚再生株系途徑。同一種植物的不同品種間由于基因型的差異，其再生能力也具有較大的差異；木薯再生及遺傳轉化體系已在少數(shù)幾個模式材料獲得了成功，但由于基因型的差異，很難直接運用到栽培品種中[8-11]。目前，我國主要栽培的木薯品種再生及遺傳轉化體系尚未有效建立，這成為采用植物分子育種技術對其進行改良的瓶頸。

4結論

研究發(fā)現(xiàn)，4個栽培品種間的再生能力有較大差異，從大到小依次為GR3、SC205、GR9891、GR911。筆者等通過培養(yǎng)基植物生長調節(jié)劑優(yōu)化，建立了4個木薯主要栽培品種的體細胞胚的再生體系，為建立農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化體系改良木薯栽培品種打下了良好基礎，在生產(chǎn)實踐中具有重要意義。

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