汪健芳 徐志周 嚴(yán)俊杰 李肖 張磊 黃李琳 謝寶貴

摘要：【目的】分析草菇鈣調(diào)磷酸酶催化亞基（Vv-CNA）的序列與表達，為進一步探究草菇生長發(fā)育及子實體開傘分子調(diào)控機理提供參考?！痉椒ā客ㄟ^生物信息學(xué)分析確定Vv-CNA基因的組成及保守結(jié)構(gòu)，將ORF Finder預(yù)測的草菇CNA氨基酸序列與從NCBI下載的其他真菌CNA氨基酸序列進行比對，并通過熒光定量PCR檢測Vv-CNA基因在草菇不同生長時期的相對表達量?！窘Y(jié)果】Vv-CNA基因編碼區(qū)為2503 bp，包含10個內(nèi)含子（其中I2、I8、I9和I10存在內(nèi)含子保留現(xiàn)象），編碼610個氨基酸，GenBank登錄號KX463514。將Vv-CNA氨基酸序列與動物（人、小鼠）、植物（擬南芥、水稻）和真菌（曲霉、酵母等）的CNA氨基酸序列進行同源比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vv-CNA蛋白有3個最保守的結(jié)構(gòu)域，與密褐褶菌（Gloeophyllum trabeum）的親緣關(guān)系最近。Vv-CNA基因在草菇子實體的蛋形期和伸長期高表達，以蛋形期的相對表達量最高?！窘Y(jié)論】Vv-CNA基因編碼鈣調(diào)磷酸酶催化亞基，其高表達有利于草菇菌柄的伸長。

關(guān)鍵詞： 草菇；鈣調(diào)磷酸酶催化亞基（CNA）；基因結(jié)構(gòu)；表達分析；菌柄伸長

中圖分類號： S646.13 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）03-0381-05

0 引言

【研究意義】草菇（Volvariella volvacea）質(zhì)嫩味鮮，是我國主栽食用菌之一，在我國南方地區(qū)廣泛種植。草菇屬于高溫型食用菌，生長速度快，栽培周期短，播種后一周左右出菇、10 d左右采收。草菇子實體在蛋形期細(xì)胞大量增殖與伸長，3～4 h就能使外菌膜破裂而開傘，喪失商品價值（劉學(xué)銘等，2011）。分析草菇菌柄伸長（蛋形期和伸長期）特異表達的基因，研究其結(jié)構(gòu)和功能，揭示菌柄伸長的分子機理，對控制草菇開傘具有重要的理論與實踐意義。鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin，CN）是受Ca2+/鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）直接調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，為異源二聚體結(jié)構(gòu)，其組成元件有催化亞基（CNA）和調(diào)節(jié)亞基（CNB）。CN的催化亞基A（CNA）主要由N-端區(qū)域、催化結(jié)構(gòu)域、B亞基結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和自抑制區(qū)五部分組成，調(diào)節(jié)亞基B（CNB）是Ca2+結(jié)合蛋白EF-hand家族成員之一，B亞基分子上有4個Ca2+結(jié)合位點。A亞基與B亞基相結(jié)合，才能使CN發(fā)揮對生物生長發(fā)育的重要調(diào)控作用（Herzig and Neumann，2000；Rusnak and Mertz，2000；Ke and Huai，2003）?！厩叭搜芯窟M展】目前關(guān)于CN的研究在動物、植物和真菌中均有報道。Molkentin等（1998）發(fā)現(xiàn)，在小鼠肥大的心臟肌肉組織中，CN活性及去磷酸化的NFAT（Nuclear factor of activated T cells）含量均大幅度增加，用CN抑制劑處理CN轉(zhuǎn)基因小鼠，小鼠的平均心臟重量明顯減小，心臟發(fā)育趨向正常水平；Parsons等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CNA發(fā)生變異時，大鼠慢縮型纖維組織比例明顯下降，用環(huán)孢素A抑制CN活性，大鼠骨骼肌出現(xiàn)由慢縮纖維向快縮纖維轉(zhuǎn)化。Gu等（2008）在研究水稻抗逆性過程中發(fā)現(xiàn)，CBL8（Calcineurin B-like protein 8）的上調(diào)表達可提高水稻在高鹽環(huán)境下的耐受性；Cheong等（2010）的研究結(jié)果表明，CBL5（Calcineurin B-like protein 5）在擬南芥中的過量表達可增強其對高鹽和干旱脅迫的耐受性。在真菌方面，Steinbach等（2006）在缺失CNA的煙曲霉突變菌株中發(fā)現(xiàn)其菌絲生長量明顯減少，孢子的形成也受到嚴(yán)重影響；張世偉（2014）研究表明，在破壞CNA結(jié)構(gòu)的球孢白僵菌中，其細(xì)胞壁厚度減小、細(xì)胞壁成分發(fā)生變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁完整性受到影響?！颈狙芯壳腥朦c】現(xiàn)有關(guān)于CN的研究主要在動物、植物和真菌上，在食用菌中的研究較少，在草菇上未見相關(guān)研究報道。福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心已完成了草菇基因組和不同生長發(fā)育時期表達譜的測序工作，以此為切入點，分析與草菇菌柄生長相關(guān)的基因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對草菇基因組和表達譜數(shù)據(jù)進行分析，找到一個CNA編碼基因，運用相關(guān)生物信息學(xué)方法確定該基因編碼蛋白的性質(zhì)與功能，及其在草菇不同生長時期的表達規(guī)律，旨在為進一步探究草菇生長發(fā)育及子實體開傘分子調(diào)控機理提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗草菇菌株H1521由福建主栽品種屏優(yōu)一號（PY）分離的2個單孢菌株P(guān)Yd15和PYd21配對雜交獲得。PYd15、PYd21和H1521均由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏與管理中心保藏。

1. 2 基因結(jié)構(gòu)分析

將從Scaffold上預(yù)測獲得的基因序列向前、后各延伸3 kb，使用這一序列作為初始參考序列，在Zoom Lite 1.5.4上對轉(zhuǎn)錄組測序片段進行定位（Morrissy et al.，2009），找到轉(zhuǎn)錄起始、終止位點和內(nèi)含子位點及其可變剪接的位置。采用ORF Finder對截獲的cDNA序列進行開放閱讀框區(qū)域預(yù)測，獲得其編碼的完整氨基酸序列。將獲得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行BLASTp分析，進一步驗證基因同源性（劉朋虎等，2013）。

1. 3 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

分別從NCBI、UniProt（http：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中下載其他物種的CNA氨基酸序列，運用ClustalX進行同源比對分析，預(yù)測Vv-CNA的保守結(jié)構(gòu)域。

1. 4 序列比對和系統(tǒng)進化分析

將開放閱讀框讀取的氨基酸序列與從NCBI下載的其他真菌CNA氨基酸序列運用MEGA 5.0（Tamura et al.，2011）的Muscle法進行序列比對，并采用最大似然法進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建，Bootstrap自檢值設(shè)為1000。

1. 5 基因表達量檢測

采用E.Z.N.A.TMPlant RNA Kit試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司），分別提取草菇鈕扣期、蛋形期、伸長期和成熟期的菌柄樣品總RNA，采用TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One Step gDNA Removal）試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）反轉(zhuǎn)錄得到不同時期的cDNA樣品，作為熒光定量PCR的模板。具體程序和步驟參照試劑盒說明書。

根據(jù)Zoom定位的內(nèi)含子位點，用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，采用草菇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，引物序列見表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10.0 μL，上、下游引物（0.4 μmol/L）各0.4 μL，模板（cDNA）2.0 μL，ddH2O 7.2 μL，總體積20.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。

1. 6 統(tǒng)計分析

采用2-△△Ct計算目的基因的相對表達量（Livak and Schmittgen，2001），每個樣本重復(fù)3次。運用SPSS Statistics.19中的單因素ANOVA分析，進行LSD方差齊性檢驗，對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

通過Zoom Lite 1.5.4進行轉(zhuǎn)錄組定位，結(jié)果顯示，Vv-CNA基因編碼區(qū)長度為2503 bp，序列共包含10個內(nèi)含子，其中4個內(nèi)含子（I2、I8、I9、I10）存在保留現(xiàn)象（圖1）。通過ORF Finder對Vv-CNA基因的cDNA序列進行閱讀搜索，得到一個長度為1833 bp的完整閱讀框，該閱讀框編碼610個氨基酸。該基因已上傳至NCBI，GenBank登錄號為KX463514。

2. 2 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

將Vv-CNA氨基酸序列與動物（人、小鼠）、植物（擬南芥、水稻）及真菌（曲霉、酵母等）中的CNA氨基酸序列進行同源比對，結(jié)果（圖2）表明，Vv-CNA蛋白有3個最保守的結(jié)構(gòu)域，分別為GD（I/V）HG、GDYVDR和GNHE。其中，D、H和N為金屬離子結(jié)合位點（用三角號標(biāo)出），DR和H為活性部位中非常保守的位點（用下劃線標(biāo)出）（張志新等，2008）。這些保守結(jié)構(gòu)域的存在進一步驗證了Vv-CNA蛋白為鈣調(diào)磷酸酶催化亞基的推定。

2. 3 系統(tǒng)進化分析結(jié)果

將ORF Finder預(yù)測的Vv-CNA氨基酸序列與其他一些真菌CNA氨基酸序列通過序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。由圖3可知，Vv-CNA編碼蛋白與毛韌革菌（Stereum hirsutum）、云芝（Trametes versicolor）及密褐褶菌（Gloeophyllum trabeum）等擔(dān)子菌屬蛋白聚在同一進化支上，其中與密褐褶菌的親緣關(guān)系最近。這些進化樹數(shù)據(jù)均支持蛋白Vv-CNA為草菇中鈣調(diào)磷酸酶催化亞基的推定。

2. 4 Vv-CNA基因在草菇菌柄伸長過程中的差異表達分析結(jié)果

針對Vv-CNA基因序列設(shè)計引物并進行熒光定量PCR檢測，圖4顯示，與鈕扣期相比，Vv-CNA基因的相對表達量在草菇生長的蛋形期和伸長期呈顯著上調(diào)表達（P<0.05），成熟期呈下調(diào)表達。由此可推測，CN在草菇菌柄伸長生長過程中發(fā)揮一定的作用。

3 討論

CN是參與代謝調(diào)控的重要因子，其酶活功能主要由A亞基體現(xiàn)，B亞基起調(diào)節(jié)作用，B亞基與A亞基緊密地結(jié)合時，CN才能發(fā)揮其功能（Ke and Huai，2003）。相關(guān)研究表明，Ca2+和鈣調(diào)蛋白共同調(diào)節(jié)CN活性，參與細(xì)胞活化、增殖、凋亡及對逆境等多種生命活動的調(diào)控（Klee et al.，1998；Zhao et al.，1998；Batistic and Kudla，2004；Steinbach et al.，2006）。

本研究首次從草菇基因組中獲得一個鈣調(diào)磷酸酶催化亞基編碼基因（Vv-CNA），經(jīng)相關(guān)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Vv-CNA開放閱讀框長度1833 bp，含有4個內(nèi)含子保留位點，編碼610個氨基酸，CNA蛋白具備CNA最保守的結(jié)構(gòu)域，但與其他物種尚存在一定差異。通過系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)Vv-CNA與密褐褶菌（G. trabeum）相似性最高，通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)Vv-CNA基因在草菇蛋形期和伸長期菌柄呈上調(diào)表達，由此可推測該基因與草菇菌柄伸長有關(guān)。

張世偉（2014）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)破壞CNA時，細(xì)胞壁變薄，且細(xì)胞壁中多糖含量上升，幾丁質(zhì)含量明顯下降，對細(xì)胞壁合成抑制劑剛果紅的敏感性明顯增強。由此表明，CN影響細(xì)胞壁的合成及其結(jié)構(gòu)完整性。草菇等大型擔(dān)子菌菌柄的伸長主要取決于細(xì)胞的伸長生長，而細(xì)胞的伸長主要由細(xì)胞壁的延伸所引起（Kües and Navarro-González，2015）。由此推測，Vv-CNA基因在蛋形期和伸長期菌柄中的上調(diào)表達可提高細(xì)胞壁的合成能力，從而促進菌柄細(xì)胞的伸長。由Ca2+參與的鈣調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是真核生物中影響生長過程的重要通路。CN調(diào)節(jié)途徑是調(diào)節(jié)Ca2+濃度的關(guān)鍵途徑，草菇中CN的發(fā)現(xiàn)有利于進一步探究其Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用機制，但要獲得CN在草菇鈣離子信號通路中的具體作用機制還需進一步研究。

4 結(jié)論

Vv-CNA基因在草菇生長的蛋形期和伸長期表達量顯著上調(diào)，推測該基因高表達有利于草菇菌柄的伸長。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）