曾巧英 凌秋平 胡斐

摘要 [目的]研究5種提取方法對(duì)甘蔗汁中DNA提取的效果。[方法]以甘蔗種莖中獲得的蔗汁為材料，采用2種植物基因組提取試劑盒柱式法和磁珠法、SDS法、CTAB法及簡(jiǎn)化提取法5種方法提取DNA，對(duì)比所提取的DNA濃度、純度及后續(xù)PCR擴(kuò)增的影響。[結(jié)果]以SDS法提取獲得的蔗汁DNA濃度最高，平均可達(dá)377.50 ng/mL。而柱式法的試劑盒，提取的DNA濃度最低，PCR檢測(cè)沒(méi)有能夠獲得特異的目標(biāo)條帶，不適合用于蔗汁DNA的直接提取。雖然簡(jiǎn)化法提取的DNA濃度較低，但是能夠滿足PCR擴(kuò)增的要求，由于不涉及氯仿等有害物質(zhì)，操作簡(jiǎn)單，適用于對(duì)DNA質(zhì)量要求不高時(shí)的快速提取。[結(jié)論]SDS法最適合用于蔗汁中DNA的提取。

關(guān)鍵詞 甘蔗；蔗汁；DNA提取

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）25-0136-03

Abstract [Objective]To study the effects of five methods on total DNA extraction from sugarcane juice.[Method]In this study， five methods， including two kinds of the plant DNA extraction kit （with column and magnetic bead， respectively）， CTAB method， SDS method and simplified DNA extraction method were used to extract DNA from sugarcane juice collected from seedstem， and the quality and quantity of DNA and the following PCR analysis were compared. [Result]SDS method was appropriate for DNA extraction from sugarcane juice and obtained highest amount of DNA from sugarcane juice （377.50 ng/μL， on average）. DNA yield from the plant DNA extraction kit （with column） was lowest and might interfere the following PCR analysis， so this method was not suitable for directly extracting DNA from sugarcane juice. The simplified DNA extraction method had advantage of simple and fast. Although its yield and purity were lower than those extracted by SDS and CTAB methods， it meet the demand of the following PCR analysis and was suitable for fast extraction with lower quality requirement. [Conclusion] SDS method was appropriate for DNA extraction from sugarcane juice.

Key words Sugarcane；Sugarcane juice；DNA extraction

甘蔗是世界重要的糖能兼用作物，地區(qū)及各國(guó)間的種質(zhì)交流非常廣泛，對(duì)甘蔗進(jìn)行種質(zhì)鑒定、病害及轉(zhuǎn)基因成分等檢測(cè)是必不可少的程序。目前，基于PCR的分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、轉(zhuǎn)基因、病害檢測(cè)等方面[1-2]，而開(kāi)展分子標(biāo)記檢測(cè)的基礎(chǔ)是獲得用于檢測(cè)的DNA。

研究人員對(duì)提取甘蔗DNA開(kāi)展了大量的研究，這些方法大多數(shù)是傳統(tǒng)的SDS法、CTAB法及在此基礎(chǔ)上的改良提取方法，以甘蔗葉片為主要的研究材料[3-6]。由于甘蔗葉片中含有多酚、多糖等物質(zhì)，會(huì)影響提取DNA的質(zhì)量及后續(xù)PCR，通常用酚、氯仿等試劑去除多酚等物質(zhì)，傳統(tǒng)方法提取步驟較多，比較繁瑣。甘蔗主要采用種莖進(jìn)行繁殖，各地區(qū)和國(guó)家間的引種也以種莖為主。由于甘蔗萌芽、出苗時(shí)間較長(zhǎng)，要獲得可以提取DNA的葉片需要等待的時(shí)間也較長(zhǎng)。通過(guò)種莖獲得少量蔗汁，利用蔗汁提取DNA可以縮短獲取DNA的時(shí)間。李建勇等[7]發(fā)現(xiàn)利用改良的SDS法提取蔗汁中DNA的產(chǎn)率較高，濃度可達(dá)235.30 ng/μL，產(chǎn)率雖然低于葉片，但能夠滿足下游分子試驗(yàn)的要求，而且其操作過(guò)程簡(jiǎn)便。目前有關(guān)蔗汁DNA提取方法的研究還很少。該研究以從種莖中獲得的蔗汁為材料，對(duì)比傳統(tǒng)的SDS法、CTAB法、柱式法、磁珠法和簡(jiǎn)化提取法提取DNA的效率，以期獲得最佳的蔗汁DNA提取方法，提高甘蔗分子標(biāo)記檢測(cè)的效率。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘蔗品種為ROC22，2016 年9 月采自廣州甘蔗糖業(yè)研究所種質(zhì)資源圃。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗材料處理。

將甘蔗莖砍成小塊，用特制的夾鉗榨取蔗汁，取500 μL置于2 mL 的離心管中，每處理各設(shè)4次重復(fù)。

1.2.2 DNA提取方法。

采用5種DNA提取方法進(jìn)行蔗汁DNA的提取，分別是2種植物基因組提取試劑盒（柱式法和磁珠法）、SDS法、CTAB法和簡(jiǎn)化法。

1.2.2.1 柱式法。采用TaKaRa公司的MiniBEST Plant Genomic DNA，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行DNA提取，最后用50 μL的ddH2O洗脫。

1.2.2.2 磁珠法。采用天根的磁珠法植物基因組提取試劑盒，按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行DNA的提取，最后用50 μL的洗脫液將DNA從磁珠上洗脫。

1.2.2.3 SDS法。將500 μL SDS提取緩沖液（含500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L EDTA、2%SDS、0.2% β-巰基乙醇，pH 8.0）加入材料中，65 ℃溫浴30 min，期間顛倒混勻，冰上放置10 min，加入80 μL 10 mol/L的NH4AC，4 ℃下12 000 r/min 離心10 min，取上清轉(zhuǎn)到新的1.5 mL離心管中，加入500 μL氯仿/異戊醇（24∶1）抽取2 次，12 000 r/min 離心10 min。水相加入等體積異丙醇，靜置10 min。12 000 r/min 離心10 min，棄上清，75%乙醇洗沉淀2次，沉淀干燥后加50 μL的ddH2O溶解。

1.2.2.4 CTAB法。將500 μL 預(yù)熱至65 ℃的CTAB 提取液（含1.4 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、3% CTAB、0.2% β-巰基乙醇，pH 8.0）加入材料中，65 ℃溫浴30 min，期間顛倒混勻，加入500 μL氯仿/異戊醇（24∶1）抽取2次，12 000 r/min 離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)到新的1.5 mL 離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫沉淀10 min，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，75%乙醇洗沉淀2 次。沉淀干燥后加50 μL的ddH2O溶解。

1.2.2.5

簡(jiǎn)化法。根據(jù)Xin等[8]的方法稍作修改進(jìn)行蔗汁DNA的提取。先加入500 μL的異丙醇，靜置10 min，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，75%乙醇洗沉淀2 次，干燥5 min。加入100 μL Buffer A（含100 mmol/L NaOH、2% Tween 20），95 ℃溫浴10 min，加入100 μL Buffer B（含100 mmol/L Tris-HCl、2 mmol/L EDTA，pH 8.0）混勻靜置3 min，12 000 r/min 離心5 min后，取上清。

1.2.3 DNA檢測(cè)。

1.2.3.1 分光光度計(jì)檢測(cè)。取2.5 μL DNA用ddH2O稀釋到100 μL，用Eppendorf的核酸蛋白測(cè)定儀（D30）測(cè)定所提DNA的A260/A280及濃度。

1.2.3.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。分別取2.5 μL DNA 在1% 瓊脂糖凝膠（含50 μg/g的EB替代物，TaKaRa）中電泳分析DNA質(zhì)量，凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

1.2.3.3 PCR檢測(cè)。以甘蔗的內(nèi)標(biāo)基因乙酰乳酸合酶基因（ScALS）和內(nèi)參基因β-tubulin設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列分別為ScALS-F ‘CTCCCAGTGAAGGTCTTTGCG，ScALS-R ‘TGCTGGAATGTTGAACCCTT T[9]；TUB-F ‘CCAAGTTCTGGGAGGTGATCTG，TUB-R ‘TTGTAGTAGACGTTGATGCGCTC[10]。 PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為171、103 bp。以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（50 μL）如下：10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）5 μL，LaTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μmol/L，模板2.5 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃5 min；94 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法獲得的DNA濃度檢測(cè)

以無(wú)菌水為對(duì)照，測(cè)定樣品A260/A280比值和DNA濃度，5種提取方法獲得的A260/A280比值有所不同。其中，以CTAB法提取的DNA質(zhì)量最好，A260/A280值在1.91～1.96，其次是SDS法，說(shuō)明這2種方法對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)、色素、鹽和小分子物質(zhì)等雜質(zhì)去除效果較好；這2種方法獲得的DNA濃度也較高，其中SDS法獲得的平均濃度為377.50 ng/μL，比CTAB法獲得的DNA濃度高了13.96%。柱式法提取的DNA濃度最低，測(cè)得的A260/A280不穩(wěn)定，在1.28～2.94。磁珠法獲得的DNA A260/A280在1.37～1.64，濃度高于柱式法獲得的DNA濃度。由于簡(jiǎn)易提取法僅通過(guò)堿裂解將DNA從細(xì)胞中釋放出來(lái)，沒(méi)有經(jīng)過(guò)去蛋白等程序，因此獲得的DNA質(zhì)量最差，A260/A280值在1.17～1.19，雖然獲得的濃度值較高，但是受多糖、色素、蛋白等影響，這個(gè)測(cè)定值并未反映真實(shí)的結(jié)果。

2.2 不同提取方法獲得的DNA凝膠電泳檢測(cè)

取2.5 μL DNA樣品進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，從電泳結(jié)果來(lái)看，以柱式法和磁珠法提取的DNA由于濃度低，通過(guò)凝膠電泳并未見(jiàn)到顯著的條帶（圖1）；SDS和CTAB法提取的DNA條帶清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象，所得DNA完整性較好；以簡(jiǎn)易法提取的DNA通過(guò)電泳并未見(jiàn)到顯著的DNA條帶，但是在DNA條帶上方有模糊的條帶，可能是蛋白多糖等物質(zhì)。

2.3 不同提取方法獲得的DNA后續(xù)PCR結(jié)果

以根據(jù)甘蔗的ScALS基因設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別取2.5 μL的模板（50 μL體系），分析不同提取方法對(duì)后續(xù)PCR的影響。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。5種方法中，除了柱式法提取的DNA無(wú)法獲得明顯的擴(kuò)增條帶以外，其他4種方法都可以獲得特異性的目的條帶，其中SDS法和CTAB法擴(kuò)增條帶高于磁珠法和簡(jiǎn)單提取法。

以甘蔗內(nèi)參基因β-tubulin設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除了柱式法提取的DNA無(wú)法獲得明顯的擴(kuò)增條帶以外，其他4種方法均可以獲得特異性的目標(biāo)條帶，而且獲得的DNA擴(kuò)增條帶亮度差異不大（圖3）。由此可見(jiàn)，這5種方法中，除了柱式法以外，其他方法獲得DNA均滿足下游PCR擴(kuò)增試驗(yàn)的要求，以SDS和CTAB法提取的質(zhì)量、產(chǎn)量及后續(xù)的分子試驗(yàn)效果優(yōu)于其他方法，而簡(jiǎn)單提取法雖然DNA質(zhì)量不高，但是也可以用于PCR擴(kuò)增獲得特異的目的條帶。

3 討論與結(jié)論

目前，植物基因組DNA提取方法主要有基于離心柱表面的樹(shù)脂或硅膠膜對(duì)DNA特異性吸附的柱式法富集DNA，利用磁珠表面官能團(tuán)吸附DNA的磁珠法，傳統(tǒng)的基于堿裂解的SDS法和CTAB法。這幾種方法在提取DNA過(guò)程中各有優(yōu)劣[11-13]，利用介質(zhì)吸附DNA的方法（柱式法和磁珠法），由于不涉及這些有害物質(zhì)，對(duì)環(huán)境和人體的傷害較小，而且許多商業(yè)化的植物提取試劑盒被開(kāi)發(fā)出來(lái)，極大地簡(jiǎn)化了操作步驟，方便快速，已經(jīng)開(kāi)始逐步取代傳統(tǒng)的SDS法和CTAB法。磁珠吸附的方法可以用于機(jī)械自動(dòng)化提取，提高DNA提取的效率[14]。

該研究對(duì)比了5種不同的DNA提取方法提取蔗汁DNA的效率及其對(duì)后續(xù)PCR的影響，結(jié)果顯示柱式法不適宜直接用于蔗汁DNA提取，這可能是由于蔗汁中含有的DNA量較少，而柱式法對(duì)DNA提取的效率要低于傳統(tǒng)的CTAB法[15]。另外在對(duì)果汁、飲料等DNA的提取過(guò)程中，往往需要進(jìn)行預(yù)處理，一般是通過(guò)直接離心沉淀，或加入異丙醇等后離心沉淀進(jìn)行富集，再進(jìn)行DNA提取，這樣可以避免水分對(duì)裂解的影響[16-17]。該研究中采用的蔗汁沒(méi)有經(jīng)過(guò)預(yù)處理，蔗汁中含有大量的水分，在裂解過(guò)程中加入相同量的裂解液時(shí)，降低了裂解液中各組分的濃度，使得裂解的效果降低，這也是導(dǎo)致柱式法獲得DNA數(shù)量較少的原因。盡管磁珠法在提取植物基因組DNA中的效率要高于傳統(tǒng)的CTAB法[18]，但是由于存在與柱式法類(lèi)似的問(wèn)題，在植物細(xì)胞裂解過(guò)程中受蔗汁含水量的影響，裂解效率降低，同時(shí)磁珠與蛋白結(jié)合時(shí)也受到影響，導(dǎo)致DNA的提取效率下降。雖然通過(guò)電泳無(wú)法檢測(cè)到DNA，但是提取的DNA仍然可以用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得特異性的條帶，因此可以直接用于蔗汁中DNA提取。

CTAB法由于可以有效地把植物組織中的多糖沉淀下來(lái)，提取的DNA蛋白質(zhì)和RNA 污染少，純度較高[11]。研究顯示利用CTAB法提取的甘蔗DNA無(wú)明顯降解，質(zhì)量較高，比較適合用于RAPD、Southern 雜交分析，因此CTAB法比SDS法更適合從甘蔗葉片提取基因組DNA[19]。在對(duì)甘蔗汁DNA的提取中，采用SDS法提取獲得的DNA濃度要高于CTAB法，而且兩者質(zhì)量差異不大，由此可見(jiàn)SDS法比較適合用于直接從蔗汁中提取DNA。相對(duì)于其他4種方法，簡(jiǎn)化提取法不涉及酚氯仿等有毒試劑，操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較少，而且提取的DNA穩(wěn)定性比較好[8]。雖然提取液中的DNA實(shí)際含量較低，但是基本上滿足PCR的要求，適用于大量、快速進(jìn)行蔗汁DNA的提取。

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