何福玲　凌正寶　肖俊　郭忠寶　鐘歡　楊弘　陳文治　唐瞻楊　單丹　梁軍能　甘西　羅永巨

摘要：【目的】了解人工選擇偏好對(duì)奧利亞羅非魚遺傳多樣性的影響，為今后人工選育及生產(chǎn)提供參考依據(jù)?！痉椒ā繉?duì)兩個(gè)奧利亞羅非魚群體（那馬群體和武鳴群體）各70尾個(gè)體的線粒體DNA的D-loop區(qū)序列、CoI基因和Cytb基因進(jìn)行測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化研究，并選用20對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】基于D-loop區(qū)序列兩個(gè)群體共檢測(cè)出32個(gè)單倍型，其中共享單倍型6個(gè)；基于CoI基因共檢測(cè)出23個(gè)單倍型，其中共享單倍型16個(gè)；基于Cytb基因共檢測(cè)出14個(gè)單倍型，其中共享單倍型10個(gè)。基于D-loop區(qū)序列、CoI基因和Cytb基因單倍型分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，武鳴群體和那馬群體的個(gè)體交錯(cuò)在一起，地理差異不明顯，且采用NJ法和ME法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的進(jìn)化拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本相似。20對(duì)微衛(wèi)星引物均能在奧利亞羅非魚中獲得穩(wěn)定有效的擴(kuò)增條帶，其中有18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)呈多態(tài)性；那馬、武鳴群體的平均等位基因數(shù)（Na）分別為6.5000和7.9444，平均有效等位基因數(shù)（Ne）分別是3.9857和4.7268，平均觀測(cè)雜合度（Ho）分別為0.7123和0.7752，平均期望雜合度（He）分別為0.9614和0.9711、平均Nei期望雜合度分別為0.7017和0.7636，均表現(xiàn)為武鳴群體略高于那馬群體。兩個(gè)群體的遺傳分化系數(shù)（Fst）在不同微衛(wèi)星位點(diǎn)間差異明顯，其變化范圍為0.0173（GM241）～0.2318（UNH868），平均0.0997；從單群體近交系數(shù)（Fis）和總?cè)后w近交系數(shù)（Fit）來(lái)看，所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的數(shù)值均為負(fù)值?！窘Y(jié)論】經(jīng)短期人工選擇的武鳴群體奧利亞羅非魚遺傳多樣性較被長(zhǎng)期人工選擇的那馬群體遺傳多樣性豐富，即短期內(nèi)的不同人工選擇偏好對(duì)線粒體DNA的遺傳影響較小。

關(guān)鍵詞： 奧利亞羅非魚；人工選擇；線粒體DNA；微衛(wèi)星標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： S965.125 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）02-0341-09

Abstract：【Objective】Influences of artificial selection preference on Oreochromis aureus genetic diversity were studied to provide some reference for O. aureus breeding and production. 【Method】Sequence and phylogeny of mitochondrion DNA D-loop region， Cytb gene and COI gene from 140 individuals of two O. aureus populations（70 from Nama population and 70 from Wuming population） were studied. Meanwhile， 20 pairs of microsatellite primers were applied to analyze the genetic diversity. 【Result】Thirty haplotypes were detected based on D-loop region and six of them were shared haplotypes； twenty-three were detected based on CoI gene and sixteen were shared haplotypes； fourteen were detected based on Cytb gene and ten were shared haplotypes. Phylogenetic trees based on D-loop region sequence， CoI gene and Cytb gene indicated that the individuals from Wuming population and Nama population interveined and showed no obvious geographical difference. Evolution topology of phylogenetic trees based on Neighbor-joining（NJ） method and Minimum-evolution（ME）method were similar. All 20 pairs of microsatellite primers could obtain stable and effective amplified bands from O. aureus， and 18 microsatellite loci presented polymorphism. Average allele numbers（Ne） for Nama population and Wuming population were 6.5000 and 7.9444 respectively， average effective allele numbers（Ne） were 3.9857 and 4.7268， average observed heterozygosity（Ho） were 0.7123 and 0.7752， average expected heterozygosity（He） were 0.9614 and 0.9711， average Nei expected heterozygosity were 0.7017 and 0.7636. All the indexes for Wuming population were higher than those of Nama population. There was obvious difference of coefficient of genetic differentiation（Fst） at different microsatellite loci， ranging from 0.0173（GM241）-0.2318（UNH868） with an average of 0.0997. From the perspective of inbreeding coefficient of single group（Fis） and inbreeding coefficient of total groups（Fit）， the values of all microsatellite loci were negative. 【Conclusion】Genetic diversity of Wuming population which was artificially selected for short term is more abundant than that of Nama population which was artificially selected for long time. In another words， influence of artificial selection on mitochondria DNA is small in short term.

Key words： Oreochromis aureus； artificial selection； mitochondria DNA； microsatellite marker； genetic diversity

0 引言

【研究意義】奧尼雜交羅非魚是以尼羅羅非魚為母本、奧利亞羅非魚為父本雜交獲得的優(yōu)良品種，因具有雄性率高、抗寒力強(qiáng)、抗病力好、餌料系數(shù)低、耐運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)而深受廣大養(yǎng)殖戶青睞。但由于生產(chǎn)奧尼雜交羅非魚苗種技術(shù)難度和管理要求較高，導(dǎo)致目前國(guó)內(nèi)保存奧利亞羅非魚種質(zhì)資源的苗種場(chǎng)較少。廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院于20世紀(jì)90年代從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心引進(jìn)奧利亞羅非魚，并以尾鰭條紋為主選性狀選育至今（保存于廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院那馬基地，下稱那馬群體）。2010年，廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院再次從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心引進(jìn)奧利亞羅非魚（保存于廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院武鳴基地，下稱武鳴群體）。通過(guò)對(duì)比這兩個(gè)群體的遺傳差異，了解不同人工選擇偏好對(duì)群體遺傳結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)今后人工選育及生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】線粒體DNA因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、呈母性遺傳、進(jìn)化速度快且不發(fā)生重組，作為一種生物遺傳標(biāo)記已廣泛用于系統(tǒng)進(jìn)化研究（Van Goethem et al.，2001）。其中，線粒體D-loop區(qū)是線粒體內(nèi)高度變異的控制區(qū)，多態(tài)性較高，廣泛應(yīng)用于群體遺傳分析（Lai et al.，2005）；Cytb基因進(jìn)化速度適中，很大程度傾向于轉(zhuǎn)換、顛換，適用于分析種間系統(tǒng)發(fā)育差異（Li et al.，2006）；CoI基因相對(duì)保守同時(shí)有足夠的變異，序列長(zhǎng)度適宜，且可用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，常作為一種可靠的分子標(biāo)記應(yīng)用于種屬系統(tǒng)進(jìn)化研究（Matsumoto，2003）。微衛(wèi)星DNA又被稱為短串連重復(fù)（Short tandem repeats，STRs），是以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（1～6個(gè)）為單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，多態(tài)性高且呈共顯性遺傳，被認(rèn)為是研究群體遺傳變異的最佳標(biāo)記之一，已廣泛應(yīng)用于物種起源進(jìn)化、遺傳多樣性分析和動(dòng)植物遺傳育種等研究領(lǐng)域（張濤等，2010）。近年來(lái)，越來(lái)越多學(xué)者將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到羅非魚的相關(guān)研究中。郭奕惠等（2009）通過(guò)分析我國(guó)主要養(yǎng)殖羅非魚的COI基因，探討了其種間親緣關(guān)系，并證實(shí)線粒體COI基因可作為羅非魚種類鑒別和親緣關(guān)系分析的重要標(biāo)記；馬慶男等（2013）在馬來(lái)西亞紅羅非魚、奧尼羅非魚、吉富羅非魚、新吉富羅非魚4群體中建立了TRAP分子標(biāo)記體系，該體系可用于羅非魚遺傳多樣性研究及種類鑒定；李建林等（2015）利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析來(lái)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心和廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院兩個(gè)吉富羅非魚群體的遺傳差異，結(jié)果表明，兩個(gè)吉富羅非魚群體遺傳多樣性水平較高，均存在雜合子過(guò)?，F(xiàn)象，群體間遺傳分化程度中等，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，且選育空間大?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，鮮見(jiàn)利用線粒體DNA結(jié)合微衛(wèi)星DNA的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)研究不同奧利亞羅非魚群體系統(tǒng)發(fā)育及其遺傳多樣性的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于線粒體D-loop區(qū)、Cytb基因和CoI基因測(cè)序進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化研究，并通過(guò)微衛(wèi)星DNA技術(shù)對(duì)兩個(gè)人工選擇奧利亞羅非魚群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在了解人工選擇偏好對(duì)奧利亞羅非魚遺傳多樣性的影響，為今后人工選育及生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的兩個(gè)奧利亞羅非魚群體（那馬群體和武鳴群體）來(lái)源一致，均由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心以同一祖先群體繁衍獲得，但二者選擇偏好不同，且分隔之后再無(wú)基因交流。分別采集那馬群體和武鳴群體奧利亞羅非魚鰭條（各70尾個(gè)體），采集樣本分別剪尾鰭于95%乙醇固定，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 奧利亞羅非魚總DNA提取

奧利亞羅非魚總DNA的提取采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶K裂解法（Sambrook et al.，1989）結(jié)合Tris飽和酚+氯仿/異戊醇抽提法。

1. 3 線粒體相關(guān)片段引物合成

從GenBank中導(dǎo)出奧利亞羅非魚的線粒體DNA全序列（登錄號(hào)GU370125.1），利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)3對(duì)引物（表1）分別用于擴(kuò)增線粒體D-loop區(qū)、Cytb基因和CoI基因，所有引物由上海英濰捷基生物公司合成。

1. 4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s；5 ℃ 35 s；72 ℃ 50 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后送至上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1. 5 線粒體序列相關(guān)數(shù)據(jù)分析

原始測(cè)序峰圖文件首先利用拼接軟件Phred進(jìn)行處理，使每個(gè)堿基的質(zhì)量值在20以上，然后在默認(rèn)參數(shù)條件下以Phrap進(jìn)行拼接。拼接結(jié)果和堿基質(zhì)量通過(guò)Consed檢查，手工去除錯(cuò)誤拼接，再用ClustalX對(duì)序列進(jìn)行對(duì)位排列，由MEGA 5.0計(jì)算序列堿基組成、密碼子使用頻率和群體間遺傳距離，并計(jì)算出其變異位點(diǎn)數(shù)，最后采用鄰接法（Neighbor-joining method，NJ法）、最小進(jìn)化法（Minimum-evolution method，ME法）分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。另外，采用DnaSp v5.10計(jì)算單倍型數(shù)、單倍型間核苷酸差異數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)及核苷酸多樣性指數(shù)。

1. 6 微衛(wèi)星引物合成

從已發(fā)表文獻(xiàn)（張庭等，2009；曹祥，2010）查找?jiàn)W利亞羅非魚的微衛(wèi)星引物20對(duì)（表2），分別對(duì)每對(duì)引物的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，并委托上海英濰捷基生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成。

1. 7 微衛(wèi)星檢測(cè)

以20對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)兩個(gè)奧利亞羅非魚群體的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳進(jìn)行分離，電泳緩沖液1×TBE，電壓280 V，電泳3 h左右。用0.5%冰醋酸固定3 min，2%硝酸銀染色5 min，雙蒸水漂洗2次（第1次20 s，第2次2 min），0.54%甲醛顯影約5 min，最后用預(yù)冷的0.5%冰醋酸終止反應(yīng)。顯色后用GD S7500凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，再以GelWorks1D 3.0對(duì)每對(duì)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增獲得的DNA分子量進(jìn)行估算。

1. 8 微衛(wèi)星數(shù)據(jù)分析

以電泳凝膠板上的10 bp DNA ladder Marker為參照，然后用Map Gene讀取PCR產(chǎn)物的片斷大小，記錄并錄入Excel 2007。使用Microsatellite Analyser（MSA）統(tǒng)計(jì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的期望雜合度（He）、觀測(cè)雜合度（Ho）和等位基因數(shù)（Na）（Dieringer and Schl-tterer，2003）；并以CERVUS 4.0分析每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（Marshall et al.，1998），了解其多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 線粒體序列分析結(jié)果

基于D-loop區(qū)序列，那馬群體的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)、平均核苷酸差異數(shù)分別為0.795、0.00176和1.640，武鳴群體的分別為0.822、0.00191和1.788；基于COI基因，那馬群體的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)、平均核苷酸差異數(shù)分別為0.711、0.00057和0.911，武鳴群體的分別為0.770、0.00075和1.197；基于Cytb基因，那馬群體的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)、平均核苷酸差異數(shù)分別為0.494、0.00065和0.739，均低于武鳴群體的0.677、0.00090和1.022。

2. 2 序列單倍型分析結(jié)果

基于D-loop區(qū)序列對(duì)兩個(gè)奧利亞羅非魚群體進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果表明，從武鳴群體和那馬群體的140尾奧利亞羅非魚中共檢測(cè)出單倍型32個(gè)。其中，共享單倍型6個(gè)，占所定義單倍型總數(shù)的18.75%。在所有定義的單倍型中，分布最廣泛的單倍型是Hap_24，那馬群體中有16尾、武鳴群體中有15尾均共用此單倍型。其余的26個(gè)單倍型均為獨(dú)享單倍型，且分布較均勻。

基于CoI基因序列對(duì)兩個(gè)奧利亞羅非魚群體進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果表明，從兩個(gè)群體的140尾奧利亞羅非魚中共檢測(cè)出單倍型23個(gè)。其中共享單倍型16個(gè)，占所定義單倍型總數(shù)的69.57%，其比例遠(yuǎn)高于基于D-loop區(qū)序列得出的結(jié)果。分布最廣泛的共享單倍型為Hap_1，那馬群體中有14尾、武鳴群體中有17尾均共用此單倍型。其余的7個(gè)單倍型為獨(dú)享單倍型，在兩個(gè)群體中呈不規(guī)則分布。

基于Cytb基因序列對(duì)兩個(gè)奧利亞羅非魚群體進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果表明，從兩個(gè)群體的140尾奧利亞羅非魚中共檢測(cè)出單倍型14個(gè)。其中，共享單倍型10個(gè)，占所定義單倍型總數(shù)的71.43%。單倍型Hap_2分布最廣泛，那馬群體中有20尾、武鳴群體中有25尾均共用此單倍型，在各自群體中出現(xiàn)的比例分別為57.14%和71.43%。

2. 3 單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

2. 3. 1 基于D-loop區(qū)序列的單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù) 從GenBank下載薩羅羅非魚（Sarotherodon melanotheron）、尼羅羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、鱸魚（Lateolabrax japonicus）、香魚（Plecoglossus altivelis）、虹鱒（Oncor-

hynchus mykiss）、鯉魚（Cyprinus carpio）和斑馬魚（Danio rerio）的D-loop區(qū)序列，對(duì)應(yīng)的GenBank登錄號(hào)詳見(jiàn)表3。結(jié)合已測(cè)得的奧利亞羅非魚D-loop區(qū)序列單倍型，利用MEGA 5.1基于Kimura雙參數(shù)模型分別應(yīng)用NJ法和ME法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。由圖1和圖2可知，采用NJ法和ME法構(gòu)建的奧利亞羅非魚D-loop區(qū)序列單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示出相似的進(jìn)化拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，各單倍型在個(gè)體間均勻交錯(cuò)分布，未出現(xiàn)明顯的分支。兩個(gè)群體的個(gè)體交錯(cuò)在一起，未體現(xiàn)出差異性，表明群體間遺傳距離較近，并出現(xiàn)一定的遺傳分化。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)均顯示，奧利亞羅非魚與尼羅羅非魚、薩羅羅非魚有很近的親緣關(guān)系，與鯉魚、斑馬魚的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，即與傳統(tǒng)的形態(tài)生物學(xué)分類一致。

2. 3. 2 基于COI基因的單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù) 由從圖3和圖4可看出，兩種方法構(gòu)建的奧利亞羅非魚COI基因單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示出相似的進(jìn)化拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，各單倍型在個(gè)體間均勻交錯(cuò)分布，未出現(xiàn)明顯分支。武鳴群體和那馬群體的個(gè)體交錯(cuò)在一起，地理差異不明顯，表明這兩個(gè)群體間遺傳距離很近，并出現(xiàn)一定的遺傳分化。兩個(gè)群體的奧利亞羅非魚先與尼羅羅非魚聚為一支，再與薩羅羅非魚聚為一支，最后才與鱸魚、香魚、虹鱒、鯉魚和斑馬魚聚為一支。該結(jié)果與本研究的D-loop區(qū)序列單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致。

2. 3. 3 基于Cytb基因的單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù) 由圖5和圖6可知，基于NJ法和ME法構(gòu)建的奧利亞羅非魚Cytb基因單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示出相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。各單倍型在個(gè)體間均勻交錯(cuò)分布，未出現(xiàn)明顯分支。武鳴群體和那馬群體的個(gè)體交錯(cuò)在一起，地理差異不明顯，表明這兩個(gè)群體間遺傳距離很近，并出現(xiàn)一定的遺傳分化。兩個(gè)群體的奧利亞羅非魚先與薩羅羅非魚聚為一支，再與尼羅羅非魚聚為一支，與本研究的D-loop區(qū)序列、CoI基因單倍型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果略有不同。

2. 4 PAGE凝膠電泳結(jié)果

運(yùn)用20對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)兩個(gè)奧利亞羅非魚群體各30尾個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PAGE凝膠電泳，結(jié)果表明，20對(duì)微衛(wèi)星引物均能在奧利亞羅非魚中獲得穩(wěn)定有效的擴(kuò)增條帶。其中，有18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)呈多態(tài)性，占總數(shù)的90%；而微衛(wèi)星GM542和GM376位點(diǎn)在兩個(gè)奧利亞羅非魚群體中表現(xiàn)出單態(tài)性，占總數(shù)的10%。部分微衛(wèi)星引物在奧利亞羅非魚中的PAGE凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖7。

2. 5 奧利亞羅非魚群體位點(diǎn)多態(tài)性分析結(jié)果

從表4可看出，兩個(gè)群體的Na存在一定差異，武鳴群體的平均Na（7.9444）明顯高于那馬群體（6.5000）。在那馬群體中，Na最低的是位點(diǎn)UNH868，最高的是位點(diǎn)GM221；在武鳴群體中，Na最低的是位點(diǎn)UNH860和GM603，最高的是位點(diǎn)UNH104。那馬、武鳴群體的平均有效等位基因數(shù)（Ne）分別是3.9857和4.7268，平均Shannon指數(shù)（I）分別為1.4453和1.6777，平均Ho分別為0.7123和0.7752，平均He分別為0.9614和0.9711、平均Nei期望雜合度分別為0.7017和0.7636，均表現(xiàn)為武鳴群體略高于那馬群體，但二者間差異不明顯，說(shuō)明兩個(gè)奧利亞羅非魚群體間的遺傳多態(tài)性水平差異并不明顯。在PIC方面，那馬、武鳴群體的PIC變化范圍分別為0.375（UNH868）～0.853（GM221）和0.457（UNH957）～

0.888（UNH995），說(shuō)明這18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在奧利亞羅非魚群體中具有較高的多態(tài)性。

2. 6 奧利亞羅非魚群體的遺傳分化與基因流

由表5可看出，兩個(gè)群體的遺傳分化系數(shù)（Fst）在不同微衛(wèi)星位點(diǎn)間差異明顯，其變化范圍為0.0173 （GM241）～0.2318（UNH868），平均0.0997。這表明僅有9.97%的變異存在于群體間，而90.03%的變異存在于群體內(nèi)，進(jìn)一步說(shuō)明奧利亞羅非魚群體內(nèi)的遺傳變異是其總變異的主要來(lái)源。此外，奧利亞羅非魚群體間的基因流（Nm）變化范圍為0.8285（UNH868）～14.1990（GM241），不同位點(diǎn)間的Nm差異明顯，群體間的平均Nm為2.2568，數(shù)值較高，與奧利亞羅非魚群體間遺傳分化程度較小相一致。而從單群體近交系數(shù)（Fis）和總?cè)后w近交系數(shù)（Fit）來(lái)看，所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的數(shù)值均為負(fù)值，說(shuō)明這兩個(gè)奧利亞羅非魚群體無(wú)論是在總體水平還是群體內(nèi)個(gè)體間，均表現(xiàn)出雜合體過(guò)?，F(xiàn)象。

3 討論

3. 1 兩個(gè)奧利亞羅非魚群體的D-loop區(qū)、CoI基因和Cytb基因比較分析

本研究結(jié)果表明，在那馬群體線粒體DNA的D-loop區(qū)、CoI基因、Cytb基因發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)分別為24、15和12個(gè)，在武鳴群體線粒體DNA的對(duì)應(yīng)變異位點(diǎn)分別為25、20和16個(gè)，說(shuō)明線粒體D-loop區(qū)序列、CoI基因、Cytb基因均可作為檢測(cè)奧利亞羅非魚群體遺傳多樣性的有效分子標(biāo)記。核苷酸位點(diǎn)變異主要分為顛換和轉(zhuǎn)換。李娜等（2008）對(duì)閩浙地區(qū)線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果在D-loop區(qū)序列中檢測(cè)到5個(gè)變異位點(diǎn)，在Cytb基因僅檢測(cè)到1個(gè)變異位點(diǎn)，且所有的變異位點(diǎn)均為轉(zhuǎn)換，未發(fā)生顛換。梁宏偉等（2009）對(duì)3種中國(guó)鯉線粒體DNA D-loop區(qū)進(jìn)行研究，結(jié)果在3種中國(guó)鯉上共檢測(cè)到37個(gè)變異位點(diǎn)，包含2個(gè)插入、28個(gè)轉(zhuǎn)換和7個(gè)顛換，堿基的替換有明顯偏倚。動(dòng)物線粒體DNA在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，發(fā)生轉(zhuǎn)換的頻率遠(yuǎn)高于發(fā)生顛換的頻率。本研究發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)也是以轉(zhuǎn)換為主，沒(méi)有顛換發(fā)生，符合魚類線粒體DNA進(jìn)化的特點(diǎn)。

3. 2 兩個(gè)奧利亞羅非魚群體的遺傳多樣性比較分析

遺傳多樣性參數(shù)主要由單倍型多樣度和核苷酸多樣度構(gòu)成，單倍型多樣度和核苷酸多樣度越高，表明群體的遺傳多樣性越豐富，變異程度更高（張瑞光等，2010）。本研究根據(jù)D-loop區(qū)、CoI基因、Cytb基因分析得出的群體遺傳多樣性結(jié)果一致，結(jié)果顯示武鳴群體的單倍型多樣度、核苷酸多樣度均高于那馬群體，表明武鳴群體的奧利亞羅非魚遺傳多樣性更豐富，其群體變異程度更高。生物群體的變異程度與其進(jìn)化速率呈正比，遺傳變異越豐富，群體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，進(jìn)化潛力就越大（Webster et al.，2003；Makarieva and Gorshkov，2004；Spielman et al.，2004；Garant et al.，2005；Postma and van Noordwijk，2005）。這對(duì)遺傳育種工作提出了新要求，如何在保持選育效率的同時(shí)盡可能地避免遺傳多樣性降低是今后育種工作的一個(gè)重要問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)，基于D-loop區(qū)序列檢測(cè)出的遺傳多樣性參數(shù)比基于CoI基因和Cytb基因檢測(cè)出的遺傳多樣性參數(shù)高，說(shuō)明D-loop區(qū)序列作為反映奧利亞羅非魚群體遺傳多樣性的敏感度優(yōu)于CoI基因和Cytb基因，也進(jìn)一步證明D-loop區(qū)序列變異性更高。

3. 3 兩個(gè)奧利亞羅非魚群體的微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性比較分析

從微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果可看出，兩個(gè)奧利亞羅非魚群體的遺傳多樣性偏高（Ne=4.3563，Ho=0.7438，He =0.9663，PIC=0.697），略高于宋紅梅等（2008）利用尼羅羅非魚微衛(wèi)星引物對(duì)橙色莫桑比克羅非魚進(jìn)行遺傳多樣性分析的結(jié)果。本研究中，武鳴群體的平均Ne、Ho、He均高于那馬群體，也說(shuō)明武鳴群體的奧利亞羅非魚遺傳多樣性更豐富。此外，兩個(gè)群體的遺傳分化系數(shù)（Fst）在不同微衛(wèi)星位點(diǎn)間差異明顯，其變化范圍為0.0173（GM241）～0.2318（UNH868），平均為0.0997，表明僅有9.97%的變異存在于群體間，而90.03%的變異存在于群體內(nèi)。究其原因，可能是由于武鳴群體的奧利亞羅非魚引進(jìn)時(shí)間較短，經(jīng)人工選育的次數(shù)較少，其遺傳多樣性水平更高；而那馬群體由于引進(jìn)時(shí)間較長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)多次人工選育，遺傳多樣性水平相對(duì)較低。李大宇等（2009）通過(guò)對(duì)黃顙魚的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度的人工選育會(huì)使經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的基因型頻率上升并在群體中進(jìn)一步純化均一，導(dǎo)致其遺傳多樣性水平有所降低。因此，如何在保持選育效率的同時(shí)盡可能地避免遺傳多樣性降低是今后育種工作的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

經(jīng)短期人工選擇的武鳴群體奧利亞羅非魚遺傳多樣性較被長(zhǎng)期人工選擇的那馬群體遺傳多樣性豐富，即短期內(nèi)的不同人工選擇偏好對(duì)線粒體DNA的遺傳影響較小。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）