維生素C對藏西北絨山羊精液冷藏效果及其全基因組DNA甲基化的影響

宋天增　任子利　趙彥玲　吳玉江　徐亞歐　孫鋒博

摘要：【目的】研究維生素C對4 ℃保存藏西北絨山羊精液效果及其全基因組DNA甲基化的影響，為高效利用藏西北絨山羊種公羊精液及推廣其人工授精技術(shù)打下基礎(chǔ)?！痉椒ā考訇幍廊斯げ杉匚鞅苯q山羊種公羊新鮮精液，用維生素B12進(jìn)行4倍稀釋后添加不同濃度的維生素C（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mg/mL），4 ℃保存24 h，觀察統(tǒng)計其精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率，并通過實時熒光定量PCR檢測精子全基因組DNA甲基化的情況?！窘Y(jié)果】藏西北絨山羊精液4 ℃保存24 h后，以添加8.0 mg/mL維生素C的效果最佳，對應(yīng)的精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率分別為（73.41±0.47）%、（58.89±0.88）%和（68.76±0.81）%，3個指標(biāo)均極顯著高于未添加維生素C的空白對照組（P<0.01）。添加8.0 mg/mL維生素C的藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化水平與新鮮精液的接近，均顯著低于未添加維生素C的冷藏精液（P<0.05）?！窘Y(jié)論】原精液中添加2.0 mg/mL維生素C可降低4 ℃保存藏西北絨山羊精液的全基因組DNA甲基化異常水平，提高藏西北絨山羊精液冷藏效果。

關(guān)鍵詞： 藏西北絨山羊；精液；維生素C；冷藏；DNA甲基化

中圖分類號： S826.83 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）02-0357-04

Abstract：【Objective】This study investigated the effects of vitamin C on Northwest Tibet Cashmere Goat semen preserved at 4 ℃ and levels of the complete genome DNA methylation， in order to lay a foundation for utilization of ram semen and promotion of artificial insemination technique in the future. 【Method】Fresh semen of ram of Northwest Tibet Cashmere Goat was collected using artificial Vagina. Vitamin C of different concentrations（0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 and 12.0 mg/mL） were added into the semen 4-time diluted with vitamin B12 and preserved at 4 ℃ for 24 hours. Sperm motility， acrosomal integrity and plasma membrabe integrity were observed and complete genome DNA methylation was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The Northwest Tibet Cashmere Goat semen after 24 hours preserved at 4 ℃ with 8.0 mg/mL vitamin C showed the best quality. Sperm motility was（73.41±0.47）%， acrosomal integrity（58.89±0.88）% and plasma membrabe integrity（68.76±0.81）%. The three indexes were higher than those of control which added no vitamin C（P<0.01）. At the same time， the level of sperm complete genome DNA methylation was close to that of fresh semen， and significantly lower than those of semen added no vitamin C（P<0.05）. 【Conclusion】Adding 2.0 mg/mL vitamin C in Northwest Tibet Cashmere Goat semen preserved at 4 ℃ can reduce the level of DNA methylation and increase the quality of sperm preserved at refrigeration temperature.

Key words： Northwest Tibet Cashmere Goat； semen； vitamin C； refrigeration； DNA methylation

0 引言

【研究意義】藏西北絨山羊又稱克什米爾山羊（益西多吉等，2009），已完全適應(yīng)高海拔地區(qū)（藏西北）缺氧、無霜期短、晝夜溫差大、終年無補(bǔ)飼的惡劣自然條件，且產(chǎn)出的羊絨細(xì)度在14.5±0.5 μm，優(yōu)于我國其他絨山羊品種（索朗達(dá)等，2015）。近年來，隨著西藏特色農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)和畜禽良種工程等重點建設(shè)項目的啟動，國家畜禽良種補(bǔ)貼等扶持政策相繼落實，藏西北絨山羊良種需求日益增多，因此人工授精技術(shù)在藏西北絨山羊種公羊的高效利用中也倍受重視?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】維生素C是一種重要、有效的自由基清除劑，具有較強(qiáng)的還原性，參與有機(jī)體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，在畜禽精液的保存過程中發(fā)揮了重要作用（Jones and Mann，1977；趙憲林，2009）。Singh等（1996）在牛的凍精稀釋液中添加25 mmol/L維生素C，能顯著提高解凍后的精子活力，由原來的37.5%提高到46.0%。Aurich等（1997）向馬的精液中添加0.9 mg/mL維生素C，發(fā)現(xiàn)維生素C能抑制精子代謝，從而延長精子的存活時間。Sánchez-Partida等（1997）向綿羊凍精解凍液中添加50和100 mmol/L維生素C，結(jié)果發(fā)現(xiàn)解凍后精子的代謝降低，存活時間明顯延長，其原因可能是維生素C能有效防止精子磷脂發(fā)生過氧化，保護(hù)精子免受自由基的危害。趙憲林（2009）在牛精液稀釋液中添加6.0 mg/mL維生素C，測得解凍后0 h的精子活力與新鮮精液無明顯差異，表明維生素C添加濃度對解凍后的牛精子擺動幅度及鞭打頻率等影響不明顯。陳宗明等（2012）研究表明，添加3.0 mg/mL維生C可顯著提高貴州黑山羊精液的4 ℃保存效果。鄭自華等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在德保矮馬精液冷凍稀釋液中添加維生素C能有效延長精子的體外存活時間。楊波等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在兔精液稀釋液中添加維生素C可提高常溫保存的精液品質(zhì)。任子利等（2016）研究表明，在精液稀釋液中添加維生素C可降低藏豬精子基因組DNA甲基化異常水平，提高藏豬精液4 ℃保存的效果?！颈狙芯壳腥朦c】長期以來，由于山羊凍精解凍后精子活力和受胎率較低等因素，嚴(yán)重制約了山羊凍精的大面積推廣應(yīng)用。在低溫條件下，液態(tài)的山羊精液代謝水平較低，其保存時間較常溫更長，且可應(yīng)用普通冰箱4 ℃保存，經(jīng)濟(jì)方便。因此，進(jìn)一步優(yōu)化液態(tài)精液冷藏保存體系對提高山羊種公羊的利用率及推廣其人工授精技術(shù)具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在以維生素B12對藏西北絨山羊進(jìn)行4倍稀釋的基礎(chǔ)上添加不同濃度的維生素C，經(jīng)4 ℃保存24 h后觀察統(tǒng)計其精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率，探討維生素C對藏西北絨山羊精液冷藏效果的影響，并通過實時熒光定量PCR檢測精子全基因組DNA甲基化的情況，為高效利用藏西北絨山羊種公羊精液及推廣其人工授精技術(shù)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗公羊為3～5歲的健康藏西北絨山羊種公羊，共9只，假陰道人工采集其新鮮精液，以人用維生素B12進(jìn)行4倍稀釋。稀釋后精液用8層以上紗布包裹于18 ℃培養(yǎng)箱中平衡2 h，再置于4 ℃下保存24 h。維生素C購自上?，F(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司，考馬斯亮藍(lán)R 250購自上海展云化工有限公司、Diff-Quik Stain染液購自北京普博斯生物科技有限公司、精子基因組DNA提取試劑盒購自北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司、MethyFlashTM Methylated DNA Quantification Kit（Colorimetric）購自美國Epigentek公司。主要儀器設(shè)備：倒置熒光體視顯微鏡（IX73，奧林巴斯），電熱恒溫水槽（DKB-450A，上海森信實驗儀器有限公司），變頻冰箱（BCD-649WDVC，海爾）、DK-S28電熱恒溫水浴鍋（上海精宏）、UV-1100紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）、Multifuge X3高速低溫離心機(jī)和ELx808吸收光酶標(biāo)儀（美國）。

1. 2 試驗設(shè)計

1. 2. 1 維生素C對4 ℃保存藏西北絨山羊精液品質(zhì)的影響 向維生素B12 4倍稀釋的藏西北絨山羊精液中添加不同濃度的維生素C（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mg/mL），4 ℃下保存24 h后觀察統(tǒng)計其精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率，探析添加維生素C對4 ℃保存藏西北絨山羊精液品質(zhì)的影響。3次重復(fù)。

1. 2. 2 維生素C對4 ℃保存藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化的影響 根據(jù)1.2.1篩選出維生素C最佳添加濃度組（A），同時設(shè)新鮮精液組（B）和未添加維生素C組（C）。通過實時熒光定量PCR檢測不同處理組的精子全基因組DNA甲基化情況，探析維生素C對4 ℃保存藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化的影響。3次重復(fù)。

1. 3 測定項目及方法

1. 3. 1 精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率測定 精子活力常規(guī)性狀參照林嘉鵬等（2015）、唐淑紅等（2015）的方法進(jìn)行檢查，精子頂體完整率和精子質(zhì)膜完整率參照胡傳活等（2015）的方法進(jìn)行評價。

1. 3. 2 精子全基因組 DNA甲基化水平檢測 采用精子基因組DNA提取試劑盒提取不同處理組的精子全基因組DNA，以UV-1100紫外可見分光光度計檢測其濃度和純度，以瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶的清晰度和整齊性。同時，參照MethyFlashTM Methylated DNA Quantification Kit（Colorimetric）說明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算藏西北絨山羊精液樣品的DNA甲基化水平。

1. 4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，再以SPSS 11.5進(jìn)行One-way ANOVA方差分析及Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 維生素C對藏西北絨山羊精液4 ℃保存效果的影響

由表1可看出，藏西北絨山羊精液經(jīng)4 ℃保存24 h后，添加維生素C處理組的精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率均高于空白對照組，且隨著維生素C添加濃度的增加，精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率呈先升高后降低的變化趨勢。其中，以添加8.0 mg/mL維生素C的效果最佳，對應(yīng)的精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率分別為（73.41±0.47）%、（58.89± 0.88）%和（68.76±0.81）%，3個指標(biāo)均極顯著高于未添加維生素C的空白對照組（P<0.01）。

2. 2 藏西北絨山羊精子基因組DNA純度檢測結(jié)果

以UV-1100紫外可見分光光度計分別檢測維生素C最佳添加濃度（8.0 mg/mL）組（A）、新鮮精液組（B）和未添加維生素C組（C）的藏西北絨山羊精子全基因組DNA，結(jié)果表明，藏西北絨山羊精子全基因組DNA濃度為325±10 ng/μL、純度為1.9～2.0，DNA瓊脂凝膠電泳條帶整齊、清晰、單一（圖1）。將待檢藏西北絨山羊精子全基因組DNA稀釋至100 ng/μL后備用。

2. 3 維生素C對藏西北絨山羊精子基因組DNA甲基化的影響

2. 3. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 參照MethyFlashTM Methylated DNA Quantification Kit（Colorimetric）的說明，以5-甲基胞嘧啶（5-mC，50%）含量為橫坐標(biāo)、相對熒光單位為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），擬合得到回歸方程：y=1127.6x+128.8（R2=0.9978）。由圖2可看出，擬合的回歸方程線性關(guān)系良好，可用于計算5-mC含量及DNA甲基化水平。

2. 3. 2 維生素C對藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化水平的影響 維生素C最佳添加濃度（8.0 mg/mL）組（A）、新鮮精液組（B）和未添加維生素C組（C）的藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化水平如圖3所示，以C組的DNA甲基化水平最高，顯著高于A組和B組（P<0.05），而A組與B組差異不顯著（P>0.05）。表明添加8.0 mg/mL維生素C可有效降低低溫（4 ℃）對藏西北絨山羊精子DNA甲基化的影響，改善藏西北絨山羊精液低溫冷藏的效果。

3 討論

本研究結(jié)果表明，隨著維生素C添加量的增加，4 ℃保存藏西北絨山羊精液的精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率指標(biāo)呈先升高后降低的變化趨勢（拋物線），其中以添加8.0 mg/mL維生素C的效果最佳，對應(yīng)的精子活力、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率分別為（73.41±0.47）%、（58.89±0.88）%和（68.76±0.81）%，3個指標(biāo)均極顯著高于其他處理組。本研究在添加維生素C前先用維生素B12進(jìn)行4倍稀釋，相當(dāng)于原精液中的維生素C最佳添加量為2.0 mg/mL，與陳宗明等（2012）在原精液中添加3.0 mg/mL維生素C可顯著提高云貴高原4 ℃保存貴州黑山羊精液冷藏效果的結(jié)果基本一致。相差的1.0 mg/mL添加量可能與所處環(huán)境大氣壓、含氧量、環(huán)境濕度等影響冷藏產(chǎn)生的活性氧有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

Benchaib等（2005）將人類精子經(jīng)免疫組化染色后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)在輔助生殖過程中的精子全基因組DNA甲基化水平可作為研究人類精子是否具有受孕能力的一種新方法。人類精子DNA片段化與全基因組DNA甲基化間存在負(fù)相關(guān)，添加抗氧化劑可減少DNA損傷且確保精子DNA甲基化狀態(tài)正常（Tunc and Tremellen，2009）。本研究結(jié)果表明，添加8.0 mg/mL維生素C可有效降低低溫（4 ℃）保存環(huán)境對藏西北絨山羊精子全基因組DNA甲基化的影響，改善藏西北絨山羊精液低溫冷藏的效果，與任子利等（2016）在藏豬精液稀釋液中添加維生C可降低藏豬精子基因組DNA甲基化異常水平，提高藏豬精液4 ℃環(huán)境保存的效果一致。說明維生素C對藏西北絨山羊精子全基因組DNA具有較強(qiáng)的還原性，可清除因冷藏產(chǎn)生的自由基（Jones and Mann，1977；趙憲林，2009），還可有效防止精子磷脂發(fā)生過氧化，降低基因組DNA甲基化水平，保護(hù)精子免受自由基的危害。

4 結(jié)論

原精液中添加2.0 mg/mL維生素C可降低4 ℃保存藏西北絨山羊精液的全基因組DNA甲基化異常水平，提高藏西北絨山羊精液冷藏效果。

參考文獻(xiàn)：

陳宗明，密國輝，許厚強(qiáng)，張勇，趙明富，陳祥. 2012. 維生素C對貴州黑山羊低溫保存精液品質(zhì)的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（6）：146-147.

Chen Z M，Mi G H，Xu H Q，Zhang Y，Zhao M F，Chen X. 2012. Effects of vitamin C on the cryopreserved semen quality of Guizhou black goat[J]. Guizhou Agricultural Science，40（6）：146-147.

胡傳活，許春榮，陸媚，韋干顯，劉德玉，王英群，彭夏云，韋永強(qiáng). 2015. 黃芪多糖對豬精液低溫保存的影響[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，35（1）：150-154.

Hu C H，Xu C R，Lu M，Wei G X，Liu D Y，Wang Y Q，Peng X Y，Wei Y Q. 2015. Effects of astragalan on low temperature preservation of boar semen[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，35（1）：150-154.

林嘉鵬，唐淑紅，吳陽升，汪立芹，黃俊成. 2015. IGF-I對綿羊冷凍精液質(zhì)量的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，46（3）：498-502.

Lin J P，Tang S H，Wu Y S，Wang L Q，Huang J C. 2015. Effects of IGF-Ι on quality traits of sheep cryopreserved ovine semen[J]. Journal of Southern Agriculture，46（3）：498-502.

任子利，趙彥玲，王建洲，李瑜鑫，商鵬，強(qiáng)巴央宗. 2016. 維生素C對藏豬精液4 ℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，47（5）：1057-1061.

Ren Z L，Zhao Y L，Wang J Z，Li Y X，Shang P，Chamba Yangzom. 2016. Effect of vitamin C on Tibetan boar semen preserved at 4 ℃ and levels of the sperm global genome DNA methylation[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，47（5）：1057-1061.

索朗達(dá)，吳玉江，巴貴，次仁德吉，德吉，益西多吉. 2015. 影響藏西北絨山羊羊絨品質(zhì)的主要因素[J]. 畜牧與飼料科學(xué)，36（10）：81-83.

Suolangda，Wu Y J，Bagui，Cirendeji，Deji，Yixiduoji. 2015. Main factors influencing cashmere quality of northwest Tibet cashmere goat[J]. Animal Husbandry and Feed Science，36（10）：81-83.

唐淑紅，林嘉鵬，吳陽升，汪立芹，黃俊成. 2015. 谷胱甘肽（GSH）對綿羊細(xì)管凍精質(zhì)量的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，27（5）：79-83.

Tang S H，Lin J P，Wu Y S，Wang L Q，Huang J C. 2015. Effect of GSH on quality of cryopreserved ovine semen[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，27（5）：79-83.

楊波，蔡繆熒，張昊，程國虎，張佳慧. 2014. 維生素C對新西蘭白兔精液常溫保存的影響[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，（5）：40-42.

Yang B，Cai M Y，Zhang H，Cheng G H，Zhang J H. 2014. Effect of vitamin C on New Zealand white rabbit semen preserved at room temperature[J]. Shanghai Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，（5）：40-42.

益西多吉，尼珍，索朗達(dá)，吳玉江，巴貴，次仁德吉. 2009. 藏西北絨山羊產(chǎn)絨性能研究[J]. 中國草食動物，29（2）：69-70.

Yixiduoji， Nizhen， Suolangda， Wu Y J， Bagui， Cirendeji. 2009. Study on cashmere production performance of Northwest Tibet Cashmere Goat[J]. China Herbivore，29（2）：69-70.

趙憲林. 2009. 三種維生素對牛冷凍精液品質(zhì)的影響[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué).

Zhao X L. 2009. Effects of three vitamins on quality semen of cattle after freeze-thawing[D]. Yangling：Northwest A & F University.

鄭自華，趙海峰，陳寶劍，陳東峰，蔣欽楊，陸鳳花，陳集成，韋英明. 2014. 精液稀釋液中添加維生素E或維生素C對德保矮馬精液冷凍效果的影響[J]. 中國畜牧雜志，50（1）：21-24.

Zheng Z H，Zhao H F，Chen B J，Chen D F，Jiang Q Y，Lu F H，Chen J C，Wei Y M. 2014. The effects of vitamin E or vitamin C supplemented in the frozen semen dilution on Debao pony semen cryopreservation[J]. Chinese Journal of Animal Science， 50（1）：21-24.

Aurich J E，Sch■nherr U，Hoppe H，Aurich C. 1997. Effects of antioxidants on motility and membrane integrity of chilled-stored stallion semen[J]. Theriogenology，48（2）：185-192.

Benchaib M，Braun V，Ressnikof D，Lornage J，Durand P，Niveleau A，Guérin J F. 2005. Influence of global sperm DNA methylation on IVF results[J]. Human Reproduction，20（3）：768-773.

Jones R，Mann T. 1977. Damage to ram spermatozoa by peroxidation of endogenous phospholipids[J]. Journal of Reproduction and Fertility，50（2）：261-268.

Sánchez-Partida L G，Setchell B P，Maxwell W M. 1997. Epididymal compounds and antioxidants in diluents for the frozen storage of ram spermatozoa[J]. Reproduction，F(xiàn)ertility，and Development，9（7）：689-696.

Singh B，Chand D，Singh P，Yadran N. 1996. Effect of vitamin C addition to the diluent on the quality of deep frozen murrah buffalo bull（Bubalus bubalis） semen[J]. International Journal Animal Science，11：131-132.

Tunc O，Tremellen K. 2009. Oxidative DNA damage impairs global sperm DNA methylation in infertile men[J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics，26（9-10）：537-544.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）