姜秋穎++金英華++張冉冉++陳春紅++黃大勇++呂艷菊++信濤++申維喜

[摘要] 目的 探討重組人血管內(nèi)皮抑素（恩度）聯(lián)合紫杉醇對人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞抗凋亡基因Bcl-2的影響。 方法 將BALB/c裸鼠32只進行細(xì)胞培養(yǎng)，隨機分為4組，其中3個化療組（恩度組、紫杉醇組及恩度聯(lián)合紫杉醇組）和1個對照組，每組8只?；熃M為腹腔注射給藥，第1、8天各給藥1次，給藥劑量：恩度10 mg/kg、紫杉醇注射液10 mg/kg。對照組腹腔注射生理鹽水，第1、8天各注射1次。給藥15 d后處死小鼠并取出瘤體，將瘤體組織行HE染色和免疫組化SP法染色。原位末端標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡，并計算癌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。 結(jié)果 恩度組、紫杉醇組及恩度聯(lián)合紫杉醇組Bcl-2表達均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。恩度聯(lián)合紫杉醇組Bcl-2表達分別顯著低于恩度組、紫杉醇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。恩度組、紫杉醇組及恩度聯(lián)合紫杉醇組AI均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。恩度聯(lián)合紫杉醇組AI分別顯著高于恩度組、紫杉醇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 抗凋亡基因Bcl-2可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，恩度聯(lián)合紫杉醇化療可降低Bcl-2表達，促進乳腺癌細(xì)胞凋亡，因此，Bcl-2水平檢測在恩度聯(lián)合紫杉醇治療乳腺癌效果及預(yù)后評估中有重要的參考價值。

[關(guān)健詞] 乳腺癌；抗凋亡基因Bcl-2；恩度聯(lián)合紫杉醇；化療

[中圖分類號] R655.7 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（b）-0092-04

Influence mechanism of Endostar combined with Paclitaxel on human breast cancer MDA-MB-435 cell apoptosis gene Bcl-2

JIANG Qiuying JIN Yinghua ZHANG Ranran CHEN Chunhong HUANG Dayong LU Yanju XIN Tao SHEN Weixi▲

Internal Medicine-Oncology， the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Harbin 150086， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Endostar combined with Paclitaxel anti apoptosis gene Bcl-2 on human breast cancer cell line MDA-MB-435. Methods 32 BALB/c mice were cultured and randomly divided into four groups， 3 chemotherapy groups （Endostar group， Paclitaxel group and Endostar combined with Paclitaxel group） and 1 control group， 8 rats in each group. Chemotherapy groups were given intraperitoneal injection，at the first and eighth days respectively administered 1 times. Dosage： Endostar 10 mg/kg， Paclitarel injection 10 mg/kg. Control group received intraperitoneal injection of normal saline， at the first and eighth days respectively administered 1 times. After treatment for 15 d， mice were killed and the tumors were removed， HE staining and immunohistochemical SP staining were performed in the tumor tissues. Apoptosis was detected by TUNEL method， and the apoptosis index （AI） of the cancer cells was calculated. Results The expression of Bcl-2 in Endostar group， Paclitaxel group and Endostar combined with Paclitaxel group was respectively significantly higher than that of the control group， the difference was significant （P < 0.05）. And the expression of Bcl-2 in Endostar combined with Paclitaxel group was significantly higher than that of Endostar group， Paclitaxel group respectively， the difference was significant （P < 0.05）. The AI of Endostar group， Paclitaxel group and Endostar combined with Paclitaxel group was respectively significantly higher than that of the control group， the difference was significant （P < 0.05）. And AI of Endostar combined with Paclitaxel group was significantly higher than that of Endostar group， Paclitaxel group respectively， the difference was significant （P < 0.05）. Conclusion The anti apoptotic gene Bcl-2 is involved in the development and progression of breast cancer， combined with Paclitaxel chemotherapy for apoptosis of breast cancer patients by monitoring the expression of anti apoptosis gene Bcl-2 in breast cancer combined with Paclitaxel in chemotherapy， favorable for curative effect and prognosis evaluation provides an important theoretical basis.

[Key words] Breast cancer； Anti apoptosis gene Bcl-2； Endostar combined with Paclitaxel； Chemotherapy

腫瘤的發(fā)生機制比較復(fù)雜，研究證實細(xì)胞凋亡障礙是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一[1]。Bcl-2基因是Bcl-2家族中重要的抗細(xì)胞凋亡基因，研究發(fā)現(xiàn)其參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡過程，具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞增生、延長細(xì)胞壽命等作用，參與了許多腫瘤如肺癌、食管癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[2]。乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率逐年升高。乳腺癌傳統(tǒng)的治療方法有手術(shù)、放療和化療。隨著對乳腺癌生物行為學(xué)的認(rèn)識，化療在乳腺癌的治療中發(fā)揮越來越重要的作用，有效的化療藥物能顯著提高患者的生存質(zhì)量。但也存在復(fù)發(fā)的現(xiàn)象，且復(fù)發(fā)后的乳腺癌細(xì)胞還可能會對化療產(chǎn)生耐受性，因此，開發(fā)新的化療藥物或增強現(xiàn)有藥物的療效成為目前腫瘤治療的研究熱點。重組人血管內(nèi)皮抑素（恩度，Endostar/YH-16）是我國學(xué)者自主創(chuàng)新研發(fā)的新型人血管內(nèi)皮抑素，具有廣譜的抗血管生成活性，其通過抑制形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞遷移及抑制腫瘤新生血管生成，進而抑制腫瘤增殖或轉(zhuǎn)移[3]。紫杉醇為常用治療乳腺癌的化療藥物之一，國內(nèi)外已有研究表明紫杉醇能誘導(dǎo)肺癌、食管癌、乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。有研究顯示，提高化療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡水平，可提高腫瘤對化療的反應(yīng)；促進細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療的重要機制[4]。本實驗通過細(xì)胞培養(yǎng)及免疫組化原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測Bcl-2在乳腺癌組織中的表達情況，分析應(yīng)用恩度聯(lián)合紫杉醇化療對乳腺癌細(xì)胞抗凋亡基因Bcl-2的影響，旨在探討恩度聯(lián)合紫杉醇化療誘導(dǎo)Bcl-2在乳腺癌細(xì)胞中過表達而發(fā)揮抗凋亡的作用機制，從而為臨床治療乳腺癌的不同化療方案提供理論基礎(chǔ)及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

選擇BALB/c裸鼠32只，動物合格證號：0123008，飼養(yǎng)在清潔級實驗環(huán)境下（動物設(shè)施合格證號：SYXK 1120020014）。雌性，4周齡，體重15～19 g，裸鼠由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生物技術(shù)國家重點實驗室提供支持。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及制造動物模型

將人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞株（由我院實驗室保存提供）置于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，添加100 U/mL青霉素及100 mg/L鏈霉素，37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。取指數(shù)生長期約5×106/mL細(xì)胞傳代及接種24孔板中，培養(yǎng)48 h后待用。取第3、4代培養(yǎng)細(xì)胞進行移植，經(jīng)消化、清洗、染色，計數(shù)并調(diào)整使活細(xì)胞濃度為1×107/mL，于每只裸鼠右側(cè)胸壁乳墊下接種0.1 mL制造裸鼠乳腺癌模型。

1.3 分組

于裸鼠皮下注射MDA-MB-435細(xì)胞，在普通無菌室的超凈生物層流架中飼養(yǎng)，無菌操作，連續(xù)觀察2周后開始治療。將裸鼠隨機分為3個化療組（恩度組、紫杉醇組及恩度聯(lián)合紫杉醇組）和1個對照組，每組8只?；煼桨福憾鞫?、紫杉醇及兩者聯(lián)合化療?；熃M腹腔注射給藥，第1、8天各給藥1次。對照組腹腔注射生理鹽水，第1、8天各注射1次。每次給藥劑量：恩度（先聲藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字S20050088）10 mg/kg、紫杉醇注射液（江蘇揚子江藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H20058719）10 mg/kg。

1.4 免疫組化

各組裸鼠至給藥15 d后脫頸處死，取出瘤體組織置于10%福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，4 μm厚連續(xù)切片，然后行HE染色和免疫組化SP法染色，備作免疫組化和TUNEL檢測之用。鼠抗人Bcl-2單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SP試劑盒購于福州邁新試劑公司；TUNEL檢測試劑盒購自德國寶靈曼公司。參照免疫組化SP配套試劑盒說明進行。DBA顯色，自來水終止顯色反應(yīng)。所有石蠟標(biāo)本經(jīng)切片厚度約4 μm，切片常規(guī)脫蠟至水，過氧化氫室溫孵育51 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗。微波加熱抗原修復(fù)，PBS沖洗。1∶50正常羊血清封閉20 min。加入PBS稀釋的一抗，1∶100稀釋生物素化二抗。臨用前配制DAB顯色試劑，室溫30 min，自來水充分沖洗。蘇木精襯染，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。對照實驗用PBS代替一抗作陰性對照，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性標(biāo)本作陽性對照。

1.5 結(jié)果判定

Bcl-2定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，為棕黃色或棕褐色。每例切片觀察5～10個高倍視野（光鏡，200×），以計數(shù)1000個腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞百分比為標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.6 癌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）

應(yīng)用TUNEL法檢測組織中的凋亡細(xì)胞，利用HMIAS 2000高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)，每張切片選擇10個高倍視域，數(shù)1000個腫瘤細(xì)胞。計算AI。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/癌細(xì)胞總數(shù)×100%[6]。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗，進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性應(yīng)用單因素方差分析法進行多重比較方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

恩度組、紫杉醇組及恩度聯(lián)合紫杉醇組Bcl-2表達均顯著低于對照組，且恩度聯(lián)合紫杉醇組Bcl-2表達顯著低于恩度組、紫杉醇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。恩度組、紫杉醇組及恩度聯(lián)合紫杉醇組AI均顯著高于對照組，且恩度聯(lián)合紫杉醇組AI顯著高于恩度組、紫杉醇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率逐年增高，且日趨年輕化，已經(jīng)成為影響人類健康的主要疾病。美國2010年癌癥發(fā)病統(tǒng)計顯示，乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等均是女性患者發(fā)病率較高的惡性腫瘤，其中乳腺癌占28%[7]。盡管由于近些年來檢測及治療手段的提高大大降低了乳腺癌的死亡率，但無論是在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，乳腺癌依然是女性發(fā)病率及死亡率較高的腫瘤。

研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程可能與細(xì)胞凋亡調(diào)控失調(diào)密切相關(guān)[8]。細(xì)胞凋亡是在多種基因調(diào)控下進行的細(xì)胞程序性死亡。乳腺發(fā)生癌變時，機體啟動凋亡抑制機制使正常細(xì)胞凋亡通路發(fā)生障礙[9]。當(dāng)?shù)蛲鰴C制受各種因素的影響減弱甚至抑制時，增生細(xì)胞得以逃脫凋亡，使局部組織細(xì)胞繼續(xù)增生，最終形成乳腺癌[10]。

Bcl-2基因族是抑制細(xì)胞凋亡重要因子，Bcl-2抗凋亡基因是Bcl-2家族中的重要成員，定位于染色體18q21上，全長約230 kb，該基因有3個外顯子、2個啟動子和2個內(nèi)含子，編碼239個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為26 kD的Bcl-2蛋白[11]。在發(fā)生凋亡過程中，Bc1-2家族的促凋亡蛋白在凋亡相關(guān)因子激活下，易位到線粒體膜上，破壞線粒體完整性，釋放線粒體內(nèi)的促凋亡因子，經(jīng)過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑逐步放大，最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生[12]。近些年Bcl-2已被廣泛用于腫瘤病變的細(xì)胞凋亡方面的研究。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2與多種腫瘤病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其表達與腫瘤的大小、腫瘤細(xì)胞的增殖程度、腫瘤的浸潤性和預(yù)后密切相關(guān)[13]。Bcl-2基因參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程，檢測乳腺癌組織中Bcl-2基因的表達有助于預(yù)測乳腺癌的組織學(xué)分級情況及預(yù)后[14]。隨著對乳腺癌生物行為學(xué)的認(rèn)識，化療在乳腺癌的治療中發(fā)揮越來越重要的作用，而許多研究證實，許多化療藥物都是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡而達到治療的目的，如阿糖胞苷、阿霉素、甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺等，且研究證實，Bcl-2基因高表達與乳腺癌細(xì)胞對這些藥物產(chǎn)生耐藥性密切相關(guān)[15-17]。Leyre等[18]研究發(fā)現(xiàn)，針對Bcl-2表達水平的治療很有希望與常規(guī)的化療、放療一起成為乳腺癌治療的重要手段。

恩度是一種新型靶向抗癌藥物，研究證實，其具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化，促進內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用[19-20]。

紫杉醇為常用治療乳腺癌的化療藥物之一，研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇及其衍生物通過抑制微管的解聚，打破微管聚合與解聚的動態(tài)平衡，抑制紡錘體形成，使細(xì)胞不能進行正常的分裂而停滯在G2期，從而達到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，其可與順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶、阿霉素、VP-16等聯(lián)用[22]。于華楠等[17，23]研究發(fā)現(xiàn)，多西紫杉醇作為廣譜抗腫瘤藥物之一，對乳腺癌具有較好的療效，其通過采用MTT比色法分析多西紫衫醇對人乳腺癌MCF-7腫瘤細(xì)胞的增殖作用，應(yīng)用光鏡、電鏡分別進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的觀察；采用Annexirr V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率和周期變化，以及應(yīng)用免疫組化方法檢測Bcl-2基因蛋白的表達變化，研究結(jié)果證實多西紫衫醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞具有明顯抑制生長的作用，并可進一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機制可能與調(diào)節(jié)Bcl-2等凋亡基有關(guān)。且洪雷等[24]研究也證實，兩者聯(lián)合作用時誘導(dǎo)凋亡作用增強。本研究結(jié)果也證實了上述觀點，表1結(jié)果顯示，三組Bcl-2表達分別顯著低于對照組，AI分別顯著高于對照組，而聯(lián)合組Bcl-2表達分別顯著低于恩度組、紫杉醇組，AI分別顯著高于恩度組、紫杉醇組，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），證實恩度聯(lián)合紫杉醇化療方案用于乳腺癌患者具有協(xié)同促凋亡作用，通過監(jiān)測抗凋亡基因Bcl-2在乳腺癌行恩度聯(lián)合紫杉醇化療中的表達情況，有利于為評價療效及預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。

綜上所述，抗凋亡基因Bcl-2可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，恩度聯(lián)合紫杉醇化療可降低Bcl-2表達，促進乳腺癌細(xì)胞凋亡，因此，Bcl-2水平檢測在恩度聯(lián)合紫杉醇治療乳腺癌效果及預(yù)后評估中有重要的參考價值。

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（收稿日期：2016-09-04 本文編輯：王紅雙）