陳合，齊康儒*，李軼超，劉譽，胡曼，吳玉喜

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安710021；2.陜西和氏乳品有限公司，陜西寶雞721003）

響應(yīng)面法優(yōu)化兩歧雙歧桿菌益生元類凍干保護(hù)劑

陳合1，齊康儒1*，李軼超2，劉譽2，胡曼1，吳玉喜1

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安710021；2.陜西和氏乳品有限公司，陜西寶雞721003）

以兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）為試驗菌株，以凍干存活率為評價指標(biāo)，采用中心組合試驗設(shè)計對兩歧雙歧桿菌益生元類凍干保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，益生元類凍干保護(hù)劑的優(yōu)化配方為菊糖13%，水蘇糖11%，低聚木糖7%，經(jīng)重復(fù)試驗驗證后的凍干存活率是（88.7±1.3）%，與預(yù)測值無顯著性差異（P＞0.05），這說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化兩歧雙歧桿菌凍干保護(hù)劑是可行的。關(guān)鍵詞：益生元；兩歧雙歧桿菌；冷凍干燥；凍干保護(hù)劑；優(yōu)化

CHEN He1,QI Kangru1*,LI Yichao2,LIU Yu2,HU Man1,WU Yuxi1
(1.School of Food and Biological Engineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an 710021,China; 2.Shaanxi Heshi Dairy Co.,Ltd.,Baoji 721003,China)

近幾年，我國將益生菌廣泛應(yīng)用到食品中，特別是在發(fā)酵乳品中占有很大的比重，如奶酪、酸奶、面包、飲料、冰激凌等，益生菌可以促進(jìn)人體健康[1-3]。兩歧雙歧桿菌的保健功能已日益明確，它可以治療慢性腹瀉和偽膜性腸炎、保護(hù)肝臟、提高人體腸道內(nèi)鈣、磷、鐵的利用率等，該菌在藥物生產(chǎn)和食品開發(fā)相繼推出并日漸普及。然而由于兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）屬專性厭氧菌，且對營養(yǎng)要求嚴(yán)格、低pH條件下抵抗力差以及不耐氧性，所以該菌在保藏過程中很容易失活[4]。工業(yè)生產(chǎn)過程可以顯著改變微生物的結(jié)構(gòu)和功能特性，在臨床試驗或食品生產(chǎn)中使用益生菌都需要穩(wěn)定的生產(chǎn)方式[5-6]。一些研究表明，微生物在經(jīng)過適當(dāng)干燥后在室溫下長期儲存存活[7]，而凍干型的微生態(tài)制劑則能最大程度上保持菌體的活性[8]。

目前，通常利用真空冷凍干燥技術(shù)對菌種進(jìn)行保藏，凍干保護(hù)劑的添加可減少由于各種物理化學(xué)原因造成的細(xì)胞損傷從而降低細(xì)胞死亡率[9]，在冷凍干燥過程中的水的去除導(dǎo)致細(xì)胞組件結(jié)構(gòu)不完整，使細(xì)胞功能損失或減值[10]，目前冷凍過程中細(xì)胞損傷的機(jī)理主要被認(rèn)為有溶質(zhì)效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。干燥過程中細(xì)胞內(nèi)的水分被快速蒸發(fā)導(dǎo)致局部過干，從而破壞細(xì)胞的水膜保護(hù)層，損害細(xì)胞活性。因不同保護(hù)劑具有不同的特性，一般情況下多種類型保護(hù)劑按一定配方混合使用可明顯提高保護(hù)效果，研究表明，10%或20%多糖與10%脫脂牛奶混合制作的保護(hù)劑對雙歧桿菌MYL16具有最優(yōu)良的保護(hù)效果[11]，碳水化合物對益生菌有保護(hù)作用[12]，如海藻糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度顯著提高了細(xì)胞的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，從而使細(xì)胞在胞外未結(jié)冰的情況下達(dá)到玻璃相。據(jù)報道山梨醇[13]、蔗糖、乳糖[14-15]、甘露糖、菊粉、低聚果糖[16]、氨基酸等和碳水化合物具有相同的效果，同時菊芋還具有增值益生菌的能力[17]。糖作為凍干保護(hù)劑通過形成氫鍵增強(qiáng)細(xì)胞在干燥過程中的脫水耐性，這有助于在缺水的情況下維持細(xì)胞中大分子的結(jié)構(gòu)[18]，從而抵消冷凍干燥過程中產(chǎn)生的負(fù)面影響。另外，由于糖的玻璃化溫度較高，在干燥過程中仍能在蛋白質(zhì)分子附近形成玻璃態(tài)，維持蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定從而起到保護(hù)作用[19]。曹永梅等[20]對雙歧桿菌保護(hù)劑進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以蔗糖、脫脂奶粉、甘油按一定比例復(fù)配后的保護(hù)效果較佳。甘油能在過冷狀態(tài)下進(jìn)入細(xì)胞中平衡滲透壓從而減少脫水對細(xì)胞造成的傷害，糖則形成高黏度的玻璃態(tài)降低了擴(kuò)散系數(shù)，通過阻斷大分子的運動降低其滲透性[21]。各種保護(hù)劑保護(hù)機(jī)理不同，保護(hù)劑可作填充劑、作為防凍劑、抗氧化劑、酸堿調(diào)節(jié)劑、緩沖劑等有效降低細(xì)胞的死亡率。

以益生元作為凍干保護(hù)劑的產(chǎn)品對機(jī)體健康有積極的作用，在前期工作中主要利用單因素試驗分別探究了菊糖、低聚半乳糖、低聚果糖、水蘇糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖等作為凍干保護(hù)劑對兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）的保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的益生元對兩歧雙歧桿菌的保護(hù)效果存在差異，而且添加單一的保護(hù)劑后其凍干存活率低[22]。為提高凍干菌粉的存活率，避免菌粉在長期保藏中活菌數(shù)快速減少，保證菌粉的質(zhì)量滿足商業(yè)生產(chǎn)的需求，本研究在前期試驗基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面分析法中心組合試驗設(shè)計對益生元類凍干保護(hù)劑配比進(jìn)一步優(yōu)化，適宜的凍干保護(hù)劑對兩歧雙歧桿菌的應(yīng)用、質(zhì)量和保藏至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）BB01：食品與生物工程學(xué)院研究室保存。

MRS培養(yǎng)基和MRS肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、菊糖、低聚異麥芽糖、水蘇糖：北京嘉康源科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PSH-3C pH計：上海闊思電子有限公司；DH5000AB型微生物培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；XSZ-4G型顯微鏡：重慶光學(xué)儀器廠；DSX-280B手提式式蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；GT16-Φ型高速臺式離心機(jī)：北京時代北利離心機(jī)有限公司；LGJ-15D型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)與凍干操作流程

菌種活化→接種MRS肉湯培養(yǎng)基→37℃厭氧培養(yǎng)16～24 h→6 000 r/min、低溫離心15 min→不同保護(hù)劑溶液與濕菌體按2∶1（mL∶g）混合均勻→以0.75 cm的高度分裝到凍干管→-20℃預(yù)凍10～12 h→冷凍干燥16～18 h→密封保藏。

1.3.2 活菌計數(shù)

冷凍濃縮物于磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution，PBS）緩沖液中10倍梯度稀釋，采用平板計數(shù)法，厭氧37℃培養(yǎng)48 h，分別對凍干前后兩歧雙歧桿菌活菌計數(shù)并計算凍干存活率，公式如下：

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

試驗與數(shù)據(jù)利用SAS（Version，9.1.3）及Design-Expert. 8.05b統(tǒng)計軟件進(jìn)行設(shè)計擬合模型并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化益生元類凍干保護(hù)劑

依據(jù)前期試驗，選出低聚木糖（X1）、菊糖（X2）、水蘇糖（X3）三個主要影響因子，而后根據(jù)最陡爬坡試驗及其試驗結(jié)果得到菊糖，低聚木糖和水蘇糖分別以含量為13%，7%和11%作為隨后的響應(yīng)面中心組合試驗中心點。以兩歧雙歧桿菌凍干存活率（Y1）作為響應(yīng)值，采用MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種后，離心得到的菌泥除添加不同配比的凍干保護(hù)劑外其余質(zhì)量比以磷酸緩沖液作為基礎(chǔ)凍干保護(hù)劑來補齊，兩歧雙歧桿菌益生元類凍干保護(hù)劑選用3因素5水平（N=23）的響應(yīng)面試驗因素與水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 中心組合設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite design

表2 中心組合設(shè)計試驗結(jié)果Table 2 Results of central composite design experiments

利用統(tǒng)計分析軟件對表2的試驗結(jié)果建立回歸模型并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到以下回歸模型方程：

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據(jù)表3方差分析結(jié)果可知，回歸方程的F值（26.0224）＞F0.01（9，10）=4.94，表明方程描述X1、X2、X3與Y1之間存在顯著的線性關(guān)系，同時也說明這種實驗方法是有效的。表中方程平方項X12、X22、X32的P值均＜0.001，表明保護(hù)因子與菌存活率之間并不是簡單的線性關(guān)系。交互項的F值為5.828 617，表明X1、X2、X3彼此間有一定的相互影響。表3中失擬項的F值是0.027 733且P值為0.993 273表明該方程可以對實驗進(jìn)行擬和且實驗誤差小，所以該回歸方程可用于響應(yīng)面法優(yōu)化益生元類凍干保護(hù)劑的配比。

不同保護(hù)劑因子對凍干存活率大小的影響及走勢變化結(jié)果見圖1。由圖1可知，響應(yīng)值Y1隨X1和X2變化明顯，說明了響應(yīng)值Y1受X1、X2因子的影響非常大，并且極值都在拐點處出現(xiàn)。其中，凍干存活率Y1先隨著X1的增大而增大，當(dāng)最大值在中心點出現(xiàn)以后，Y1則隨著X1的增加而逐漸減小，X2對Y1的影響與X1類似，這可能是因為初始添加益生元量太少不能完全取代細(xì)胞周圍失去的水分子，當(dāng)其量過高時又會產(chǎn)生滲透壓使細(xì)胞快速失水導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損壞。圖1中的Y1值隨保護(hù)因子X3添加量的增大反而逐漸減小，一直呈下降趨勢，水蘇糖具有增值兩歧雙歧桿菌的能力培養(yǎng)后可明顯提高活菌數(shù)，這也是圖1中Y1＞1的原因，同樣地它也具有結(jié)合自由水的能力，一定程度上可以保護(hù)細(xì)胞在冷凍干燥中形成大量冰晶造成的破壞，但也會使細(xì)胞中的自由水大量流失而失去保溫性，在快速冷凍中細(xì)胞可能難以維持原有的結(jié)構(gòu)特性。

圖1 存活率隨因子變化趨勢Fig.1 Change trends of survival rates with factors

利用Design-Expert.8.05b分析軟件對X1、X2、X3交互作用進(jìn)行分析，結(jié)果分別見圖2。

圖2 低聚木糖、菊糖、水蘇糖交互作用對凍干存活率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effect of interaction between xylooligosaccharide,inulin and stachyose on freezeing survival rate

由圖2A可知，等高線形狀是一個近似圓形的橢圓，說明兩歧雙歧桿菌凍干存活率與菊糖和低聚木糖存在相互交叉影響但作用較弱，也就是說選擇X1與X2合適的配比可提高響應(yīng)值Y1的大小，但這并不能顯著提高菌的存活率。

由圖2B可知，等高線形狀是一個鞍馬形圖，說明兩歧雙歧桿菌凍干存活率受低聚木糖和水蘇糖相互交叉影響非常顯著。

由圖2C可知，等高線形狀與圖2B類似，表明菊糖和水蘇糖與兩歧雙歧桿菌凍干存活率之間具有相互交叉的影響且效果非常明顯，所以選擇X1與X3，X2與X3之間合適的配比有利于顯著提高菌存活率。

通過SAS軟件回歸分析得到X1、X2、X3三因子的極大值點，即低聚木糖、菊糖和水蘇糖含量分別為7%、13%、11%，在該條件下預(yù)測得到的兩歧雙歧桿菌凍干存活率是89.2%，低聚木糖、菊糖、水蘇糖三者之間相互協(xié)調(diào)，通過彌補活性大分子周圍失去的水分子而具有保護(hù)劑的功效。2.2驗證實驗

兩歧雙歧桿菌BB01在接種量為5%，37℃培養(yǎng)18 h，6000r/min離心15min去上清液后收集菌泥，對照組只添加PBS緩沖液作為保護(hù)劑，實驗組則是添加優(yōu)化后的益生元類作為保護(hù)劑，分別作3組平行實驗，實驗值以三者平均數(shù)為準(zhǔn)，最終得到實驗組的凍干存活率是（88.7±1.3）%，接近預(yù)測值，表明用響應(yīng)面法優(yōu)化兩歧雙歧桿菌益生元類凍干保護(hù)劑是有效可行的，凍干菌粉存活率在一定程度上顯著提高。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面中心組合實驗得到了兩歧雙歧桿菌益生元類凍干保護(hù)劑的優(yōu)化配方，優(yōu)化后配方為：菊糖含量為13%，水蘇糖含量為11%，低聚木糖含量為7%。在此條件下，雙歧桿菌的凍干存活率為（88.7±1.3）%。結(jié)果證明響應(yīng)面法用于優(yōu)化兩歧雙歧桿菌凍干保護(hù)劑是有效可行的，在一定程度上提高了兩歧雙歧桿菌的凍干存活率，同時得到了活性較高的凍干菌粉，適宜的凍干保護(hù)劑對于應(yīng)用兩歧雙歧桿菌、穩(wěn)定活菌產(chǎn)品品質(zhì)和長期儲存具有一定意義。

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TS201.3

0254-5071（2017）05-0081-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.017

2016-12-19

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目（2016KTCL02-30）

陳合（1956-），男，教授，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。

*通訊作者：齊康儒（1992-），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。