高 婷詹江華陳 揚張愛華衛(wèi)園園

膽道閉鎖與肝移植專題·論著·

JNK2、TIMP-1及CollagenⅢ在膽道閉鎖肝纖維化中的作用研究

高 婷1詹江華2陳 揚1張愛華2衛(wèi)園園1

目的 研究c—Jun氨基末端激酶2（c—Jun N-terminal kinase，JNK2）、金屬蛋白酶組織抑制劑—1（tissue inhibitor ofmetalloproteinase 1，TIMP—1）及CollagenⅢ在膽道閉鎖（BA）肝組織中的表達(dá)情況及在肝纖維化進程中的作用。 方法 選取膽管擴張癥肝活檢病例10例，為膽擴組；BA肝活檢病例15例，為BA組；BA晚期因肝功能衰竭而行肝移植患者自體肝活檢10例，為肝移植組。采用HE染色觀察并評價肝標(biāo)本纖維化程度；免疫組化染色檢測JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ在肝組織中的表達(dá)；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT—PCR）檢測肝組織中JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ基因表達(dá)情況。 結(jié)果 ①HE染色：膽擴組偶可見少許纖維細(xì)胞增生；BA組匯管區(qū)增寬，纖維組織增生、橋接纖維化現(xiàn)象普遍，可見假小葉形成；肝移植組匯管區(qū)明顯增寬，纖維組織增生較重，廣泛橋接纖維組織形成，假小葉顯著。②免疫組化：膽擴組JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ表達(dá)為弱陽性，BA組及肝移植組JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ蛋白均在肝細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中陽性表達(dá)。③半定量分析：三組JNK2（0.122±0.008、0.182±0.017和0.198±0.033），TIMP—1（0.123±0.009、0.185±0.012和0.201±0.017）和CollagenⅢ（0.126±0.012、0.194±0.008和0.208±0.033）表達(dá)比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；三組中，BA組及肝移植組JNK2、TIMP-1及CollagenⅢ表達(dá)明顯高于膽擴組（P＜0.05）；肝移植組JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ蛋白含量與BA組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）。④qRT—PCR：三組JNK2、TIMP—1和CollagenⅢmRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.221（0.17）vs 1.395（1.22）vs 1.095（1.21），H=17.686，P=0.003；0.439（0.31）vs 1.404（0.85）vs 1.571（0.66），H=20.648，P=0.000；0.917（0.09）vs1.802（1.35）vs1.957（1.30），H=15.555，P=0.007），BA組及肝移植組肝內(nèi)JNK2、TIMP—1及CollagenⅢmRNA表達(dá)含量比膽擴組高（P值均小于0.017）。 結(jié)論 JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ在BA患兒隨著肝纖維化加重而表達(dá)升高，表明其可能參與并促進BA肝纖維化進程。

膽道閉鎖；肝硬化；轉(zhuǎn)化生長因子β1；免疫組織化學(xué)

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是危及嬰幼兒生命的肝膽系統(tǒng)疾病之一，以肝內(nèi)外膽管進行性炎癥、纖維性梗阻及膽汁淤積為特點，導(dǎo)致進行性肝纖維化和肝硬化，是嬰幼兒時期肝移植的主要指征［1-2］。BA患兒早期行Kasai手術(shù)雖能緩解膽汁淤積癥狀，但仍有2／3的患兒肝纖維化繼續(xù)進展，最終發(fā)展成為肝硬化［3］。有研究證實轉(zhuǎn)化生長因子—β1（transforming growth factor—β1，TGF—β1）蛋白能夠調(diào)節(jié)機體細(xì)胞生長、分化、凋亡，TGF-β1／Smads促纖維化通路在BA肝纖維化進程中起重要作用［4］；而c—Jun氨基末端激酶2（c-Jun N—terminal kinase，JNK2）對Smad 2／3蛋白磷酸化等起重要作用［5］；有研究證實基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1（tissue inhibitors ofmetalloproteinase—1，TIMP—1）參與肝纖維化過程中的組織重塑，與肝纖維化程度密切相關(guān)［6］；而CollagenⅢ作為TGF—β1信號通路產(chǎn)物，已被證實在動物模型肝纖維化中表達(dá)增多［7］。但以上三種蛋白在BA肝組織中不同纖維化時期表達(dá)情況尚不十分清晰，本研究旨在檢測JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ三種蛋白在BA患兒肝組織中的表達(dá)情況，并探討其在BA患兒肝纖維化發(fā)展過程中的作用機制。

材料與方法

一、標(biāo)本來源與分組

本研究收集2014年1月至2016年10月入住天津市兒童醫(yī)院且確診為膽管擴張癥的患兒10例（為膽擴組），其中男性4例，女性6例，日齡248～2 123 d，平均（1 032±595）d；BA患兒15例（為BA組），其中男性7例，女性8例，日齡19～95 d，平均（54±18）d。另外收集2013年1月至2016年10月在天津市第一中心醫(yī)院行肝移植的患兒（均已行Kasai手術(shù)，后因肝功能衰竭行肝移植）10例（為肝移植組），其中男性6例，女性4例，日齡219～2 176 d，平均（1 033±516）d。本實驗均通過天津市兒童醫(yī)院及天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會審查，且患兒監(jiān)護人均簽署了知情同意書。

二、主要試劑與儀器

TIMP—1一抗工作液，二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔聚合物）、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（3，3—diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。JNK2一抗（1∶200），CollagenⅢ一抗（1∶400）購自北京博奧生物技術(shù)有限公司。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT—PCR）引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司設(shè)計及合成，引物序列見表2。主要儀器：IQ5實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），手執(zhí)式組織勻漿機（德國IKA公司）。Fast Quant RTKit（With gDNase）、TRIzol（天根生化公司），Super Real PreMix Plus（SYBR Green）。定量分析所用的ImagePro Plus 5.0自動分析系統(tǒng)購自美國Media Cybernetics公司。

三、實驗方法

1.組織學(xué)檢測：將蠟塊標(biāo)本連續(xù)4μm切片，分別進行HE染色及免疫組化染色。①HE染色。病理切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗，浸染蘇木素5 min，經(jīng)酸化伊紅乙醇液浸染2 min，梯度乙醇脫水，透明劑浸泡至透明，中性樹膠封片等一系列操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織細(xì)胞形態(tài)、肝纖維化程度。②免疫組化染色。病理切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)15 min，冷卻至室溫，PBS緩沖液沖洗5 min×3次，于3%H2O237℃中孵育10 min，再用PBS沖洗5 min×3次，滴加一抗（JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ），于冰箱中4℃過夜，次日取出置于室溫，PBS洗5 min×3次，加二抗于37℃下孵育30 min，PBS洗5 min×3次，經(jīng)DAB顯色5～10 min，鏡下觀察染色情況，充分水洗，蘇木素液染核，脫水、透明、中性樹膠封片，于低倍鏡（×100）下觀察染色（棕色）區(qū)域，高倍鏡（×400）下辨別陽性細(xì)胞種類及表達(dá)情況。③qRT—PCR。術(shù)中取各組患兒肝右葉前緣為實驗標(biāo)本，置無菌EP管中儲存在-80℃冰箱，依照TRIzol法研磨并提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，合成cDNA。PCR反應(yīng)體系共20μL，其中包括上、下游引物各0.5μL，cDNA模版1μL，10μL 2×SuperReal PreMix，無酶水補足到20μL。95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸32 s，擴增40個循環(huán)。分別測定樣本內(nèi)參（GAPDH）、JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ的基因擴增的Ct值，每個樣本重復(fù)3次，取3次結(jié)果平均值為最終Ct值；ΔCt=每個基Ct值—內(nèi)參Ct；樣本基因相對定量=2-ΔCt。

表1 JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ引物序列Table 1 Base sequences of primers for qRT—PCR for JNK2，TIMP—1 and collagenⅢ

四、免疫組化結(jié)果判斷免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn)［8］

1.定性分析：根據(jù)染色強度分為無棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽性）、棕黃色 （陽性）、棕褐色（強陽性）。

2.半定量分析：每張切片于陽性部位處取5個不同視野100倍顯微鏡下圖片，經(jīng)IPP（Image proplus）5.0分析圖片計算JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ蛋白的平均光密度值（AOD），AOD=肝組織陽性細(xì)胞光密度總和／陽性面積。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析，正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，多重比較方差齊性用Bonferroni法，非齊性用Tamhane法；非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)及四分位數(shù)間距［M（IQR）］表示，多組間比較使用Kruskal-Wallis H檢驗，多重比較用Bonferroni法進行顯著性水平校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HE染色結(jié)果

膽擴組肝組織標(biāo)本中可見少許纖維細(xì)胞增生、少量炎癥細(xì)胞；BA組肝組織標(biāo)本中可見肝細(xì)胞變性，偶有壞死，炎細(xì)胞大量增生，匯管區(qū)增寬，纖維組織增生、橋接纖維化普遍，有假小葉形成；肝移植組肝組織標(biāo)本中肝細(xì)胞嚴(yán)重變形、壞死，匯管區(qū)增寬顯著，纖維組織增生較重，廣泛橋接纖維化，假小葉明顯（見圖1）。

二、免疫組化定性分析結(jié)果

JNK2蛋白：在三組肝組織標(biāo)本的肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中均有表達(dá)，在膽擴組表達(dá)呈弱陽性，在BA組和肝移植組表達(dá)呈陽性（圖2A～C）；TIMP—1蛋白：在膽擴組肝組織標(biāo)本的肝細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中呈弱陽性表達(dá)；在BA組及肝移植組肝組織標(biāo)本的肝細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)（圖3A～C）；CollagenⅢ蛋白：在膽擴組肝組織標(biāo)本中，僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞胞質(zhì)中有弱陽性表達(dá)，而BA組及肝移植組在以上細(xì)胞胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)（圖3D～F）。

三、三種蛋白免疫組化半定量分析結(jié)果

JNK2、TIMP—1和CollagenⅢ蛋白在三組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較發(fā)現(xiàn)BA組和肝移植組肝組織標(biāo)本中JNK2、TIMP—1和CollagenⅢ蛋白表達(dá)水平均高于膽擴組（P＜0.05），但BA組與肝移植組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞

圖1 各組肝組織標(biāo)本肝纖維化程度比較（HE，×100），A：膽擴組；B：BA組；C：肝移植組。黃色箭頭表示肝細(xì)胞空泡樣變；圖2 JNK2在三組肝臟組織標(biāo)本中的表達(dá)情況（IHC，×100），A：JNK2在膽擴組的表達(dá)；B：JNK2在BA組的表達(dá)；C：JNK2在肝移植組的表達(dá)。黃色箭頭為膽管上皮細(xì)胞、紅色箭頭為血管內(nèi)皮細(xì)胞、綠色箭頭為肝細(xì)胞； 圖3 TIMP—1及CollagenⅢ在三組肝臟組織標(biāo)本中的表達(dá)情況（IHC，×100），A：TIMP—1在膽擴組中的表達(dá)；B：TIMP—1在BA組的表達(dá)；C：TIMP—1在肝移植組的表達(dá)；D：CollagenⅢ在膽擴組的表達(dá)；E：CollagenⅢ在BA組的表達(dá)；F：CollagenⅢ在肝移植組的表達(dá)。黃色箭頭為膽管上皮細(xì)胞、紅色箭頭為血管內(nèi)皮細(xì)胞、綠色箭頭為肝細(xì)胞Fig．1 Comparison of fibrosis extent of hepatic tissue specimens among three groups（HE，×100）； Fig．2 Expression patterns of JNK2 in hepatic tissue specimens of three groups（IHC，×100）； Fig．3 The expressions of TIMP-1and CollagenⅢin the liver of three groups（IHC，×100）0.05），見表2。

表2 三組患兒肝內(nèi)JNK2、TIMP—1、CollagenⅢ蛋白半定量表達(dá)Table 2 Semi-quantitative intra-hepatic expressions of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢin three groups

四、肝臟組織標(biāo)本中JNK2、TIMP—1和CollagenⅢmRNA表達(dá)水平比較

JNK2、TIMP—1和CollagenⅢ在三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較發(fā)現(xiàn)BA組及肝移植組肝組織標(biāo)本中表達(dá)水平高于膽擴組（P＜0.017），見表3。

表3 三組患兒中JNK2、TIMP—1，CollagenⅢmRNA相對含量比較［M（IQR）］Table 3 Comparison of expression levels of JNK2 etc.mRNA between three groups M［（IQR）］

討 論

BA患兒以肝內(nèi)外膽管梗阻，肝臟進行性炎癥及纖維化為主要病理特征，早期行Kasai手術(shù)可改善膽汁淤積，但不能終止其纖維化進程［9］。已有實驗研究證實TGF—β1信號通路在BA肝纖維化過程中起促進作用。在BA肝纖維化進程中，肝臟內(nèi)TGF—β1信號通路經(jīng)各種因子刺激下被激活，進而誘導(dǎo)肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Smad 2／3磷酸化，生成磷酸化—Smad 2／3（p—Smad2／3），p—Smad 2／3與Smad 4形成絡(luò)合物，并向細(xì)胞核內(nèi)移動，啟動細(xì)胞外基質(zhì)蛋白基因轉(zhuǎn)錄，促進肝纖維化進程［2，10-11］。JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ作為TGF—β1信號通路的調(diào)節(jié)蛋白及產(chǎn)物，在肝纖維化中的作用已有研究［5-7］。但其在BA患兒肝臟中的表達(dá)情況尚未見報道。本研究通過從蛋白水平及基因水平檢測JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ在BA肝內(nèi)表達(dá)情況，探討這幾種因子在BA肝纖維化進展的作用。

一、JNK2主要參與TGF—β1信號通路相關(guān)蛋白磷酸化及核易位過程，進而促進肝纖維化進程。

JNK2是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路中的不同亞型，Jiang Y等研究結(jié)果顯示MAPK信號蛋白抑制劑通過阻斷Smad 2／3磷酸化及p—Smad 2／3與Smad 4核易位，阻斷Smad 2／3／4復(fù)合物形成，進而導(dǎo)致血漿纖溶酶原激活物抑制劑—1（Plasma plasminogen activator inhibitor—1，PAIχ21）蛋白及mRNA表達(dá)降低，提示JNK2信號蛋白參與并促進肝纖維化進程［12］。p38、ERK1／2蛋白在BA肝纖維化中的作用，已在前期研究中得到證實［13］。本研究結(jié)果顯示，JNK2在BA患兒肝臟組織中肝細(xì)胞、匯管區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞胞質(zhì)等中陽性表達(dá)，其表達(dá)水平較對照組明顯增高，BA組JNK2免疫組化半定量及mRNA表達(dá)量均較對照組高，提示其可能在BA肝纖維化進程中起促進作用。

二、TIMP—1參與BA肝纖維化過程中的的組織重塑過程

TIMP—1由活化的肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生，其通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和通過抗細(xì)胞凋亡和增殖來影響MMP之間的相互作用，具體通過促進可溶性MMP與膜結(jié)合位點之間的相互作用，使可溶性MMP在細(xì)胞—基質(zhì)界面活化，進而使細(xì)胞通過基質(zhì)遷移，活化的MMP通過降解正常肝臟基質(zhì)和抑制積累的纖維狀膠原蛋白降解，來促進肝纖維化［6，14］。已有研究證實，在終末期肝硬化患者中，TIMP—1基因表達(dá)和血清水平上調(diào)［15］。而其在BA肝組織中的表達(dá)及與Kasai術(shù)后肝纖維化進展的關(guān)系則有不同觀點。本研究結(jié)果證實，其在BA患兒肝臟組織標(biāo)本中肝細(xì)胞胞質(zhì)、匯管區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)及膽管上皮細(xì)胞等呈陽性表達(dá)，其表達(dá)水平較對照組明顯增高，TIMP—1mRNA表達(dá)量也較對照組高。這些實驗結(jié)果表明TIMP-1可能通過抑制MMP—9等及影響MMP之間相互作用，進而有助于肝臟組織肝纖維化過程中組織重塑過程，并加速BA肝纖維化進程。

三、CollagenⅢ作為TGF—β1信號通路產(chǎn)物，與BA肝纖維化形成直接相關(guān)

在BA肝纖維化進展中，肝星狀細(xì)胞具有關(guān)鍵作用，當(dāng)肝組織受損后，在各種細(xì)胞因子及炎癥因子作用下，激活TGF—β1信號通路，最終使肝星形細(xì)胞轉(zhuǎn)換成肌成纖維細(xì)胞，使富含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積如Collagen，發(fā)生肝纖維化［16］。Sferra R通過動物模型證實在肝纖維化過程中，α—平滑肌肌動蛋白、CollagenI—Ⅲ和結(jié)締組織生長因子的表達(dá)增加，同時伴隨著avβ6、TGFβ1、Smad 3等表達(dá)上調(diào)［7］。Suominen JS等研究證實CollagenⅠ在BA肝組織中表達(dá)較對照組高，且Kasai手術(shù)時表達(dá)量少的自體肝生存率較表達(dá)高者預(yù)后好［17］。而對于CollagenⅢ在BA的作用目前未見文獻報道。本實驗結(jié)果顯示，在膽擴組肝組織標(biāo)本中僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞胞質(zhì)中有弱陽性表達(dá)；在BA組及肝移植組肝組織標(biāo)本中，以上細(xì)胞胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)，且CollagenⅢ在BA組及肝移植組無論在蛋白水平還是基因水平表達(dá)均高于膽擴組。由此表明CollagenⅢ作為TGF—β1信號通路產(chǎn)物，在肝纖維化進程中，可能隨著肝纖維化嚴(yán)重程度增加而持續(xù)增多，說明其在肝纖維化后期加速肝硬化進程。

綜上所述，TGF—β1在BA患兒肝纖維化中起促進作用，在肝纖維化早期階段其促進作用大于晚期肝硬化階段。另外，JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ在肝纖維化過程中表達(dá)明顯增高，JNK2可通過影響TGF—β1信號通路蛋白磷酸化及核易位進而促進肝纖維化進程；而TIMP—1則有利于肝臟組織肝纖維化過程中組織重塑，促進肝纖維化進展；CollagenⅢ作為TGF—β1信號通路產(chǎn)物細(xì)胞外基質(zhì)的組成部分之一，尤其是在肝硬化時期，對肝纖維化進程起直接作用。以上幾種蛋白對BA肝纖維化不同時期都有相應(yīng)的促進作用，在將來的研究中，是否可以通過相關(guān)抑制實驗來終止或是延緩肝纖維化進程，還有待更進一步通過建立BA小鼠慢性纖維化模型行體外抑制實驗來進一步研究。

1 詹江華，陳亞軍.肝移植時代如何看待膽道閉鎖的診治［J］.中華小兒外科雜志，2014，35（4）：245—247.DOI：10.3760／cma.j.issn.0253—3006.2014.04.003. Zhan JH，Chen YJ.How to evaluate the diagnosis andmanagement ofbiliary atresia in the era of liver transplantation［J］.Chin J Pediat Surg，2014，35（4）：245—247.DOI：10.3760／cma.j.issn.0253—3006.2014.04.003.

2 Lampela H，Kosola S，Heikkila P，et al.Native liver histology after successful portoenterostomy in biliary atresia［J］.J Clin Gastroenterol，2014，48（8）：721-728.DOI：10. 1097／MCG.0000000000000013.

3 孫穎華，鄭珊，錢薔英，等.膽道閉鎖Kasai術(shù)后超聲隨訪的應(yīng)用價值［J］.臨床小兒外科雜志，2016，15（2）：144—149.DOI：10.3969／j.issn.1671—6353.2016.02.013. Sun YH，Zheng S，Qian QY，etal.Ultrasonographic followup on the children with biliary atresia after Kasai hepatoportoenterostomy［J］.JClin Ped Sur，2016，15（2）：144—149. Doi：10.3969／j.issn.1671—6353.2016.02.013.

4 丁美云，詹江華，趙麗，等.TGF—β1、Smad2在膽道閉鎖肝纖維化中的作用［J］.天津醫(yī)藥，2016，44（7）：810—813. DOI：10.11958／20150242. Ding MY，Zhan JH，Zhao L，et al.The function of TGF—β1 and Smad2 in liver fibrosis of biliary atresia［J］.Tianjin Med J，2016，44（7）：810—813.DOI：10.11958／20150242.

5 JafriM，Donnelly B，McNealM，etal.MAPK signaling contributes to rotaviral-induced cholangiocyte injury and viral replication［J］.Surgery，2007，142（2）：192—201.DOI：10. 1016／j.surg.2007.03.008.

6 Giannandrea M，ParksWC.Diverse functions ofmatrixmetalloproteinases during fibrosis［J］.Dis Model Mech，2014，7（2）：193—203.DOI：10.1242／dmm.012062.

7 Sferra R，Vetuschi A，Pompili S，et al.Expression of profibrotic and anti-fibroticmolecules in dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis［J］.Pathol Res Pract，2016，S0344—0338（16）30641—0.DOI：10.1016／j.prp.2016.11.004.

8 姜洋，金小明，屠康.平均陽性染色面積百分比法分析免疫組化結(jié)果初探［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2007，24（3）：650—653.DOI：10.3321／j.issn：1001—5515.2007. 03.039. Jiang Y，Jin XM，Tu K.A primary study using themethod of average positive stained area percentage to measure the immunohistochemistry results［J］.Journal of Biomedical Engineering，2007，24（3）：650—653.DOI：10.3321／j.issn：1001—5515.2007.03.039.

10 Kamato D，Burch ML，Piva TJ，et al.Transforming growth factor-βsignaling：role and consequences of Smad linker region phosphorylation［J］.Cell Signal，2013，25（10）：2017—2024.DOI：10.1016／j.cellsig.2013.06.001.

11 丁美云，高婷，衛(wèi)園園，等.p—smad3在膽道閉鎖肝纖維化中的作用機制研究［J］.臨床小兒外科雜志，2016，15（1）：29—33.DOI：10.3969／j.issn.1671—6353.2016.01. 009. Ding MY，Gao T，Wei YY，etal.The study onmechanism of p-smad3 in hepatic fibrosis of biliary atresia［J］.JClin Ped Sur，2016，15（1）：29—33.DOI：10.3969／j.issn.1671—6353.2016.01.009.

12 Jiang Y，Wu C，Boye A，et al.MAPK inhibitorsmodulate Smad2／3／4 complex cyto-nuclear translocation inmyofibroblasts via Imp7／8mediation［J］.Mol Cell Biochem，2015， 406（1—2）：255—262.DOI：10.1007／s11010—015—2443—x.

13 高婷，詹江華，丁美云，等.整合素αvβ8、p38及ERK1／2在膽道閉鎖患兒肝臟中的表達(dá)及意義［J］.天津醫(yī)藥，2016，44（7）：821—824.DOI：10.11958／20150242. Gao T，Zhan JH，Ding MY，et al.The expression and significance of integrinαvβ8、p38 and ERK1／2 in the liver of children with biliary atresia［J］.Tianjin Med J，2016，44（7）：821—824.DOI：10.11958／20150242.

14 Consolo M，Amoroso A，Spandidos DA，et al.Matrix metalloproteinases and their inhibitors asmarkers of inflammation and fibrosis in chronic liver disease（Review）［J］.Int JMol Med，2009，24：143—152.DOI：10.3892／ijmm_ 00000217.

15 Kerola A，Lampela H，Lohi J，et al.Increased MMP—7 expression in biliary epithelium and serum underpins native liver fibrosis after successful portoenterostomy in biliary atresia［J］.J Pathol Clin Res，2016，2（3）：187—198. DOI：10.1002／cjp2.50.

16 Ramm GA，Nair VG，Bridle KR，etal.Contribution of hepatic parenchymal and nonparenchymal cells to hepatic fibrogenesis in biliary atresia［J］.Am J Pathol，1998，153（2）：527—535.DOI：10.1016／S0002—9440（10）65595—2.

17 Suominen JS，Lampela H，Heikkil P，et al.Myofibroblastic cell activation and neovascularization predict native liver survival and development of esophageal varices in biliary atresia［J］.World JGastroenterol，2014，20（12）：3312—3319.DOI：10.3748／wjg.v20.i12.3312.

Effects of JNK 2，TIMP—1 and collagenⅢon liver fibrosis in patients w ith biliary

atresia．Gao Ting1，Zhan Jianghua2，Chen Yang1，Zhang Aihua2，Wei Yuanyuan1．1.Graduate School，TianJin Medical University，Tianjin 300070，China；2.Municipal Pediatric Research Institute，Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300134，China.Corresponding author：Zhan Jianghua，E-mail：zhanjianghuatj＠163.com

Objective To explore the expressions of c-Jun N-terminal kinase（JNK2），tissue inhibitor ofmetalloproteinase—1（TIMP—1）and collagenⅢin liver tissues and elucidate their functions in the process of liver fibrosis of biliary atresia（BA）.M ethods Liver biopsy specimenswere collected from congenital biliary dilatation（CBD group，n=10），BA liver biopsy（BA group，n=15），BA children undergoing liver transplantation due to liver failure（liver transplantation group，n=10）.Hematoxylin and eosin（HE）staining was used for evaluating the degree of liver fibrosis.And the expressions of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢin liver tissue were detected by immunohistochemical staining.Quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT—PCR）was used to test the gene expressions of JNK2，TIMP-1 and collagenⅢ.Results①HE staining：Fiber cell hyperplasia in CBD group；Portal area expansion，fibrous tissue proliferation，bridging fibrosis and little few pseudo lobules in Kasaigroup；Portal area becamewidened obviously，fibrous tissue proliferation was heavier，bridging fibrosis generally formed，pseudo-lobular was remarkable in liver transplantation group.②Immunohistochemistry：The expressions of JNK2，TIMP-1 and collagenⅢwere weakly positive in CBD group.The positive expression of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢprotein in hepatocytic cytoplasm，portal area of bile ductepithelial cells and vascular endothelial cells in BA and transplantation groups.Semi-quantitative analysis：The expression levels of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢprotein had significant differences among three groups（0.122±0.008 vs0.182±0.017 vs0.198±0.033，F(xiàn)=75.687，P=0.000；0.123±0.009 vs 0.185±0.012 vs 0.201±0.017，F(xiàn)=99.418，P=0.000；0.126±0.012 vs 0.194±0.008 vs 0.208± 0.033，F(xiàn)=54.001，P=0.000）；BA and liver transplantation groups were significantly higher than that in CBD group（P＜0.05）.No significant differences existed in protein level between BA and transplantation groups（P＞0.05）；qRT—PCR：ThemRNA expression levels of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢhad significant differences among three groups（0.221（0.17）vs 1.395（1.22）vs 1.095（1.21），H=17.686，p= 0.003；0.439（0.31）vs 1.404（0.85）vs 1.571（0.66），H=20.648，P=0.000；0.917（0.09）vs 1.802（1.35）vs1.957（1.30），H=15.555，P=0.007）；ThemRNA expression of JNK2，TIMP-1 and collagenⅢwere higher in BA group and liver transplantation group than those of CBD group（P＜0.017）. Conclusions The expressions of JNK2，TIMP—1 and CollagenⅢincreased in liver of BA during fibrosis.It hints that the expressions of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢmay promote the process of liver fibrosis in BA.

Biliary Atresia；Liver Cirrhosis；Transforming Growth Factor beta1；Immunohistochemistry

??華.膽道閉鎖早期篩查現(xiàn)狀及對策［J］.天津醫(yī)藥，2015，43（1）：1—3.

10.3969／j.issn.0253—9896.2015. 01.001. Zhan JH.The early screening and countermeasures of biliary atresia［J］.Tianjin Med J，2015，43（1）：1—3.DOI：10. 3969／j.issn.0253—9896.2015.01.001.

2016—02—02）

（本文編輯：王愛蓮 仇 君）

高婷，詹江華，陳揚，等.JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ在膽道閉鎖肝纖維化中的作用［J］.臨床小兒外科雜志，2017，16（2）：127-132.DOI：10.3969／j. issn.1671—6353.2017.02.006.

Citing this article as：Gao T，Zhan JH，Chen Y，et al. The effects of JNK2、TIMP—1 and CollagenⅢon liver fibrosis in patients with biliary atresia［J］.J Clin Ped Sur，2017，16（2）：127-132.DOI：10.3969／j.issn.1671—6353.2017.02.006.

doi：10.3969／j.issn.1671—6353.2017.02.006

1，國家自然科學(xué)基金資助項目（項目號：81570471）；2，天津市衛(wèi)生行業(yè)重點攻關(guān)項目（14KG129）

1，天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（天津市，300070）；2，天津市兒童醫(yī)院，天津市兒科研究所（天津市，300134）

詹江華，E-mail：zhanjianghuatj＠163.com