王一俠,尹 曼,馬 濤,魯 軍,蔡木易,谷瑞增

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京 100015)

大米蛋白的BN大鼠致敏動(dòng)物模型建立

王一俠,尹 曼,馬 濤,魯 軍,蔡木易,谷瑞增*

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京 100015)

以大米蛋白為過(guò)敏原,腹腔注射致敏雌性棕色挪威大鼠(BN大鼠),建立大米蛋白過(guò)敏BN大鼠動(dòng)物模型。觀察BN大鼠全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)及體重、體溫、免疫臟器指數(shù)變化,檢測(cè)其血清特異性IgG、總IgE和特異性Ig E水平,并測(cè)定血漿組胺釋放水平及各組大鼠的血象變化。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)第42 d大米蛋白激發(fā)實(shí)驗(yàn)后,實(shí)驗(yàn)組大鼠全部呈過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性,且體溫降低,脾臟指數(shù)顯著增大(p<0.01),體內(nèi)白細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞數(shù)目升高(p<0.05);實(shí)驗(yàn)組血清特異性IgG顯著升高(p<0.01),總IgE以及血漿組胺釋放量均高于對(duì)照組(p<0.05),實(shí)驗(yàn)第14 d和42 d血清特異性IgE高于對(duì)照組,第28 d無(wú)明顯變化(p<0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明BN大鼠是評(píng)價(jià)大米蛋白致敏性較為理想的動(dòng)物模型。

大米蛋白,食物過(guò)敏原,動(dòng)物模型,抗體,組胺

近年來(lái),隨著食物過(guò)敏發(fā)生率的不斷增加,食物過(guò)敏已成為一個(gè)食品安全和公共衛(wèi)生問(wèn)題。大米是是重要的糧食作物之一,全球半數(shù)以上的人口以大米為主食[1]。大米蛋白含有豐富的必需氨基酸,其氨基酸組成模式與WHO/FAO推薦的模式接近,易于被人體消化吸收,且生物效價(jià)及蛋白質(zhì)利用率均較高。

最新研究表明,大米中含有一些過(guò)敏蛋白,包括14～16、26、33、56、60 ku等不同分子質(zhì)量大小的蛋白,其中研究較普遍的是14～16 ku的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑和33 ku具有乙二醛酶Ⅰ活性的蛋白[2]。國(guó)內(nèi)外的研究大多集中在過(guò)敏原提取純化方面,只有很少研究關(guān)注建立大米過(guò)敏動(dòng)物模型,如XiaoWei Chen[3]等利用BALB/c小鼠灌胃大米蛋白致敏,以期建立大米蛋白過(guò)敏動(dòng)物模型。但同時(shí)有研究證明BALB/c小鼠并不適合作為食物過(guò)敏的動(dòng)物模型,且灌胃易產(chǎn)生口服耐受[4]。BN大鼠是具有高IgE反應(yīng)性的種系動(dòng)物,有過(guò)敏反應(yīng)傾向,根據(jù)部分研究及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)顯示,雌性BN大鼠較雄性BN大鼠更易致敏[5-6]。因此,

表1 過(guò)敏反應(yīng)級(jí)數(shù)

本研究以提取純化并經(jīng)SDS-PAGE蛋白凝膠電泳和基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)共同驗(yàn)證的相對(duì)分子質(zhì)量為14.4～18.4 ku的大米過(guò)敏原球蛋白為致敏原,對(duì)雌性棕色挪威大鼠(BN大鼠)進(jìn)行腹腔注射致敏處理,觀察其全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng),并檢測(cè)特異性抗體、組胺、血象變化等相應(yīng)過(guò)敏指標(biāo),初步建立大米蛋白致敏動(dòng)物模型,為下一步建立大米蛋白致敏細(xì)胞模型和深入了解大米過(guò)敏引發(fā)的免疫反應(yīng)機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性棕色挪威大鼠(BN大鼠),4～6周齡,12只,體重(40～60 g),由維通利華動(dòng)物公司提供,許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001;大米 超市。

大鼠IgE酶聯(lián)免疫試劑盒和大鼠組胺試劑盒 上海酶聯(lián)免疫生物公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG 北京中杉金橋生物有限公司;四甲基聯(lián)苯胺(TMB) Sigma公司;弗氏完全佐劑和不完全佐劑 Sigma公司,Tris Amresco公司;氯化鈉、固體硫酸銨、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉試劑均為分析純 北京化工廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大米球蛋白的制備 干燥大米粉碎得到大米粉末,以濃度為1.0 mol/L,料液比1∶5(g/mL)的NaCl溶液鹽提,室溫震蕩提取16 h,8000 r/min離心20 min,上清液加入固體硫酸銨至溶液飽和度為50%,4 ℃冰箱鹽析,離心,沉淀以50 mmol/L Tris-HCl(pH9.0)緩沖液復(fù)溶,離心,上清調(diào)pH至4.02,4 ℃靜置過(guò)夜,離心,上清以20 mmol/L PBS(pH7.4,含0.15 mol/L NaCl)緩沖液透析并凍干[7]。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理 12只雌性BN大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組6只[8-10]。實(shí)驗(yàn)前采集BN大鼠血清作為對(duì)照。采取腹腔注射方式致敏,分別于第1、5、10 d分別腹腔注射1 mL 濃度為1 mg/mL大米過(guò)敏蛋白(含弗氏佐劑,大米過(guò)敏蛋白和弗氏佐劑體積比為1∶1;第一次致敏為弗氏完全佐劑,第二次和第三次致敏為弗氏不完全佐劑),第42 d注射大米過(guò)敏蛋白進(jìn)行激發(fā),對(duì)照組注射同等劑量的PBS緩沖液(pH7.4)。分別于第14、28、42 d內(nèi)眥靜脈取血,離心分離血清,用于特異性抗體IgG、IgE和總IgE測(cè)定;于第14、21、35 d天內(nèi)眥靜脈取血,加入抗凝劑EDTA-2K,離心分離血漿,用于測(cè)定組胺。

1.2.3 BN大鼠全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)評(píng)價(jià) 在第42 d對(duì)BN大鼠腹腔注射1 mL濃度為4 mg/mL的大米過(guò)敏蛋白進(jìn)行激發(fā),在激發(fā)實(shí)驗(yàn)前后40 min分別測(cè)量各組BN大鼠體溫,計(jì)算BN大鼠在激發(fā)前后體溫變化;腹腔激發(fā)后,觀察各BN大鼠反應(yīng)癥狀并參考何仁靜等[11]評(píng)分系統(tǒng)按照表1進(jìn)行評(píng)分:

若平均反應(yīng)達(dá)到2級(jí)即認(rèn)為發(fā)生了過(guò)敏反應(yīng)[12],其中平均過(guò)敏級(jí)數(shù)及過(guò)敏率按下列公式計(jì)算:

其中:n′:發(fā)生過(guò)敏的動(dòng)物總數(shù);RA:過(guò)敏率。

1.2.4 BN大鼠體重、免疫臟器指數(shù)測(cè)定 飼喂期間,每周稱體重兩次,計(jì)算平均體重,激發(fā)取血后處死BN大鼠,無(wú)菌取出胸腺和脾臟,計(jì)算免疫臟器指數(shù)[13]

1.2.5 BN大鼠免疫過(guò)程血液生化指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第14、28、42 d抗凝管取血后,血漿上血球分析儀測(cè)定。

1.2.6 血清總IgE、特異性IgE、特異性IgG、血漿組胺含量測(cè)定 血清特異性IgG(IgE)測(cè)定:采用間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè),用濃度為50 μg/mL的大米蛋白進(jìn)行包被,4 ℃過(guò)夜;0.05% PBST洗滌三次,0.5%明膠37 ℃封閉1 h;洗滌三次,每孔加100 μL按1∶100稀釋的待測(cè)血清,37 ℃孵育1 h;洗滌三次,每孔加100 μL按1∶20000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG或HRP標(biāo)記山羊抗大鼠IgE),37 ℃保濕1 h;洗滌三次,每孔加100 μL底物顯色液,37 ℃反應(yīng)15 min,每孔加50 μL l 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)OD值[14]。

血清總IgE測(cè)定和血漿組胺測(cè)定均按照ELISA試劑盒操作進(jìn)行。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Mircrosoft Excel 2007及SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,組間檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn),p<0.01具有極顯著差異;p<0.05具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 BN大鼠全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)結(jié)果及體溫變化

表2 過(guò)敏反應(yīng)結(jié)果與評(píng)分結(jié)果

注：對(duì)照組BN大鼠在第35 d取血后中因體弱死亡一只;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)除第42 d對(duì)照組為5只動(dòng)物數(shù)據(jù)外,其余均為6只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表5 不同時(shí)期BN大鼠血象水平變化(±s,N1=6,n1=5,n2=6)

注：**:與對(duì)照組比,p<0.01,差異極顯著;*:p<0.05,差異顯著,表6、表7同;對(duì)照組大鼠只數(shù):第14、28 d N1=6,第42 d n1=5;實(shí)驗(yàn)組大鼠只數(shù):第14、28、42 d n2=6,表6、圖2、圖3同。由表3可知,激發(fā)前兩組BN大鼠的體溫沒(méi)有明顯差異,對(duì)照組體溫在激發(fā)前后也沒(méi)有明顯變化,而實(shí)驗(yàn)組BN大鼠與激發(fā)前相比體溫卻明顯下降(p<0.01),由此說(shuō)明大米蛋白致敏BN大鼠時(shí)會(huì)引起其體溫迅速下降。

表3 激發(fā)前后BN大鼠體溫變化(±s,n1=5,n2=6)

注：**:p<0.01時(shí),顯著極差異;n1:對(duì)照組動(dòng)物數(shù);n2:實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物數(shù),圖1、表4同。

2.2 BN大鼠體重和免疫臟器指數(shù)變化

2.2.1 BN大鼠體重變化 實(shí)驗(yàn)期間,每周稱量BN大鼠體重兩次取平均值,結(jié)果如圖1所示,兩組BN大鼠體重均較為平衡的增長(zhǎng),組間沒(méi)有顯著差異(p>0.05),可見(jiàn)大米過(guò)敏蛋白致敏BN大鼠對(duì)其體重沒(méi)有明顯的影響。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間各組BN大鼠體重變化(±s,n1=5,n2=6)Fig.1 Body weight changes of BN rats during the experiment(±s,n1=5,n2=6)

2.2.2 BN大鼠免疫臟器指數(shù)變化 如表4所示,兩組BN大鼠的胸腺指數(shù)無(wú)差異,而實(shí)驗(yàn)組大鼠的脾臟指數(shù)卻有顯著升高(p<0.01)。過(guò)敏反應(yīng)是機(jī)體對(duì)抗原強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng),免疫防御功能過(guò)高,易于發(fā)生過(guò)敏反應(yīng),大米過(guò)敏蛋白激發(fā)后BN大鼠的脾臟指數(shù)明顯增大說(shuō)明大米蛋白已引發(fā)BN大鼠發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)[15]。

表4 大米過(guò)敏蛋白對(duì)BN大鼠脾臟指數(shù)

2.3 BN大鼠血象指標(biāo)變化

過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生時(shí),機(jī)體細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列應(yīng)急反應(yīng),這些刺激會(huì)引起機(jī)體各類細(xì)胞、血小板等數(shù)目和種類發(fā)生變化。白細(xì)胞是機(jī)體抵御異物入侵的主要防線,由粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞組成。由表5可知,免疫第14 d,中性粒細(xì)胞數(shù)目極顯著增多,(p<0.01)單核細(xì)胞數(shù)目顯著增多(p<0.05),淋巴細(xì)胞數(shù)目變化幅度不大;第42 d,白細(xì)胞數(shù)目迅速上升(p<0.01),說(shuō)明BN大鼠正處于過(guò)敏階段;食物過(guò)敏能引起嗜酸粒細(xì)胞增多,嗜酸粒細(xì)胞能夠拮抗和調(diào)節(jié)速發(fā)型超敏反應(yīng),具有吞噬能力,且能釋放組胺酶滅活組胺,抑制細(xì)胞脫顆粒[16]。但本實(shí)驗(yàn)第14、28 d時(shí)嗜酸粒細(xì)胞并沒(méi)有明顯變化,只在第42 d嗜酸粒細(xì)胞數(shù)目有明顯升高。有研究表明,過(guò)敏反應(yīng)期間存在不同的凝血因子紊亂,其中包括血小板的募集及活化,血小板可能作為抗原直接活化的效應(yīng)細(xì)胞參與不同的超敏反應(yīng)[17],在本實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)第14 d,實(shí)驗(yàn)組的血小板數(shù)量相比于對(duì)照組明顯升高(p<0.05),而第28 d與第42 d血小板的數(shù)量明顯下降,具體原因還有待進(jìn)一步研究。

2.4 BN大鼠血清特異性IgG、總IgE和特異性IgE水平變化

表6 實(shí)驗(yàn)期間BN大鼠血清總IgE變化(μg/mL)(±s,N1=6,n1=5,n2=6)

2.4.1 BN大鼠血清特異性IgG測(cè)定結(jié)果 不同時(shí)期大鼠血清特異性IgG水平變化如圖2所示,對(duì)照組在致敏不同時(shí)期血清特異性IgG無(wú)明顯變化;與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組BN大鼠在第14、28、42 d的血清特異性IgG抗體水平顯著升高(p<0.01)。

圖2 實(shí)驗(yàn)期間BN大鼠血清特異性 IgG變化(±s,N1=6,n1=5,n2=6)Fig.2 Changes in Serum specific IgG of BN rats during the experiment(±s,N1=6,n1=5,n2=6)

2.4.2 BN大鼠血清總IgE測(cè)定結(jié)果 不同時(shí)期BN大鼠血清總IgE水平變化如表6所示,實(shí)驗(yàn)第14、28 d實(shí)驗(yàn)組BN大鼠血清總IgE抗體濃度與對(duì)照組相比顯著提高(p<0.05),42 d激發(fā)實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)組血清總IgE有極為顯著的提高(p<0.01),平均可達(dá)到4.032 μg/mL。IgE是介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)(過(guò)敏反應(yīng))的主要抗體,包括總IgE和特異性IgE,總IgE水平的測(cè)定可用來(lái)鑒別超敏反應(yīng)與非超敏反應(yīng)[18]。實(shí)驗(yàn)不同時(shí)期,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有顯著差異,說(shuō)明BN大鼠發(fā)生了過(guò)敏反應(yīng)。

2.4.3 血清特異性IgE測(cè)定結(jié)果 不同時(shí)期BN大鼠血清特異性IgE水平變化如圖3所示,血清特異性IgE抗體的測(cè)定,可以明確過(guò)敏反應(yīng)是由哪種致敏原引起的(18(,實(shí)驗(yàn)第14 d和42 d實(shí)驗(yàn)組BN大鼠血清特異性IgE抗體濃度與對(duì)照組相比顯著提高(p<0.05),說(shuō)明大鼠發(fā)生的過(guò)敏反應(yīng)是由大米蛋白引起的,而實(shí)驗(yàn)第28 d兩組BN大鼠血清特異性IgE抗體濃度無(wú)顯著差異,可能是由于過(guò)敏反會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸弱化,導(dǎo)致血清特異性IgE抗體濃度降低;第42 d進(jìn)行高濃度蛋白激發(fā)后,實(shí)驗(yàn)組大鼠過(guò)敏反應(yīng)劇烈,與對(duì)照組相比,血清特異性IgE抗體濃度顯著升高(p<0.05)。

圖3 實(shí)驗(yàn)期間BN大鼠血清特異性 IgE變化(±s,N1=6,n1=5,n2=6)Fig.3 Changes in Serum specific IgG of BN rats during the experiment(±s,N1=6,n1=5,n2=6)

2.5 組胺測(cè)定結(jié)果

由表7可知,在致敏第14、21、35 d,實(shí)驗(yàn)組BN大鼠血漿組胺釋放量均顯著高于對(duì)照組(p<0.05)。

表7 實(shí)驗(yàn)期間BN大鼠組胺變化(μg/L)(±s,n=6)

3 結(jié)論與討論

動(dòng)物模型是食物致敏原檢測(cè)最直接的辦法,迄今為止報(bào)道過(guò)的用于食物過(guò)敏的動(dòng)物有狗、幼豬、豚鼠、Balb/c小鼠、C3H/HeJ小鼠、BN大鼠等[19],常用的致敏方式有灌胃、腹腔注射和皮下注射,這三者均有優(yōu)缺點(diǎn)。目前國(guó)際上尚未建立標(biāo)準(zhǔn)的食物過(guò)敏動(dòng)物模型。理想的過(guò)敏動(dòng)物模型,不僅僅是動(dòng)物暴露于食物致敏原后產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng),在暴露于無(wú)致敏史食物時(shí)也應(yīng)不產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng),且過(guò)敏癥狀應(yīng)與人類相似[20]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),BN大鼠在致敏原刺激下,能產(chǎn)生較高水平的特異性IgE、IgG抗體,具有較強(qiáng)的致敏免疫反應(yīng)[21],且相比于灌胃,腹腔注射能夠克服口服耐受的缺點(diǎn),是評(píng)價(jià)食物致敏原合適的動(dòng)物模型。Nakase[22]、Hidehiko[23]、Yumiko[24]等對(duì)大米過(guò)敏蛋白進(jìn)行過(guò)研究,結(jié)果表明相對(duì)分子質(zhì)量為14～16 ku和 33 ku的大米蛋白為致敏蛋白,可引起IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以提取的大米過(guò)敏蛋白為致敏原致敏大鼠,通過(guò)全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)判斷過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率為100%,且脾臟指數(shù)明顯增大,嗜酸粒細(xì)胞數(shù)目明顯升高。綜合以上指標(biāo)初步確定大米過(guò)敏動(dòng)物模型建立成功。

動(dòng)物體內(nèi)的特異性抗體IgG、總IgE和特異性IgE水平與致敏原敏感性相關(guān)。在食物過(guò)敏中,特異性抗體IgG的出現(xiàn),往往提示該蛋白質(zhì)具有免疫原性[25]。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)sIgG抗體檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組抗體水平明顯高于對(duì)照組,驗(yàn)證了大米蛋白首先具有免疫原性,而血清總IgE、sIgE抗體和組胺水平的檢測(cè)證明該大米蛋白不僅具有致敏性,且能引起B(yǎng)N大鼠發(fā)生過(guò)敏反應(yīng),這也與陳如程等[14]的研究相一致。然而,同一物種不同個(gè)體對(duì)過(guò)敏原的過(guò)敏性存在差異,不同物種間差異更大,僅用動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)大米蛋白的過(guò)敏性仍存在一定的局限,因此在今后的研究中將利用大鼠RBL-2H3細(xì)胞等多種模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)大米蛋白的過(guò)敏性。

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Establishment of a rice protein sensitization animal model based on BN rat

WANG Yi-xia,YIN Man,MA Tao,LU Jun,CAI Mu-yi,GU Rui-zeng*

(Beijing Engineering Research Center of Protein & Functional Peptides,China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China)

In order to establish a sensitization animal model of rice protein,the sensitinogen was intraperitoneal injected to female Brown-Norway(BN)rat. The general allergic reactions and the changes of weight,body temperature,immune organ index were observed,the level of antibody(specific IgG and IgE,total IgE)in sera,histamine and blood picture in plasma were measured to verify the animal model. Results showed that the general allergic reactions in each rat of experimental group were positive,the body temperature was decreased and the spleen index was increased significantly(p<0.01),and white blood cells and acidophilic granulocyte number were increased(p<0.05)after stimulated by rice protein at the time of 42nd day. Meanwhile,the level of specific IgG was increased significantly(p<0.01),total IgE and plasma histamine was increased(p<0.05)compared to the control group,on the 14th and 42nd days,the level of specific IgE was increased while it did not show obvious difference at the time of 28th day(p<0.05). This study indicates that the Brown Norway(BN)rat is a suitable animal model for evaluating rice protein allergenicity.

rice protein;food allergen;animal model;antibody;histamine

2016-08-19

王一俠(1990-)，女，碩士，研究方向：食物過(guò)敏原，E-mail：wyx0105@126.com。

*通訊作者:谷瑞增(1973-),男，本科，教授級(jí)高級(jí)工程師，研究方向：食源性低聚肽，E-mail：guruizeng@163.com。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863 計(jì)劃)項(xiàng)目(2013AA102205-02)；十三五國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0400604)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)05-0345-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.057