胡元慶,周贊虎,黃玉容,張燕瑜,莊 蕾

(1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000;2.揚州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室,江蘇揚州 225000;3.漳州出入境檢驗檢疫局 綜合技術(shù)服務(wù)中心,福建漳州 363000)

漳州市夏秋季主要貝類中副溶血性弧菌分布情況分析

胡元慶1,2,周贊虎3,黃玉容1,張燕瑜1,莊 蕾1

(1.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州 363000;2.揚州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室,江蘇揚州 225000;3.漳州出入境檢驗檢疫局 綜合技術(shù)服務(wù)中心,福建漳州 363000)

調(diào)查漳州市售主要貝類中副溶血性弧菌的帶菌狀況,為消費者提供食品安全風(fēng)險參考。從漳州市區(qū)的8大市場無菌采集花蛤、文蛤和蟶的新鮮樣品;用硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS)分離純化疑似菌落,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增不耐熱溶血素基因(thermolabile hemolysin,tlh)的特異片段;并對分子檢測陽性的菌株進(jìn)行生化鑒定。結(jié)果表明,采集到53份花蛤、50份文蛤和42份蟶的樣品,經(jīng)過TCBS 篩選分別得到37株、45株和36株疑似菌落,分離率分別為69.8%、90.0%和85.7%;PCR確定副溶血性弧菌陽性率分別為35.8%(19/53)、30.0%(15/50)和54.8%(23/42);革蘭氏染色和主要生化實驗確定疑似菌均為副溶血性弧菌,符合率達(dá)100%。漳州市所售水產(chǎn)品受副溶血性弧菌污染較為嚴(yán)重,市民食用需嚴(yán)格無害化處理,避免不同種類水產(chǎn)品間的交叉污染。

副溶血性弧菌,花蛤,文蛤,蟶,漳州市

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是一種革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌,是重要的污染性病原微生物。它廣泛分布于近海岸的魚類、貝類等海產(chǎn)品中,是引起食源性疾病的重要病原之一[1-2]。人們食用被副溶血性弧菌污染的食物后極可能會引起以腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱等為主要癥狀的急性腸胃炎。副溶血性弧菌所致的食物中毒已在數(shù)量上超過沙門氏菌的中毒案例,居我國食源性致病菌的首位[3]。特別是在一些沿海城市,由該菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒總數(shù)的比例達(dá)60%以上[4]。副溶血性弧菌引起的食物中毒具有明顯的季節(jié)性,以夏秋為高發(fā)季節(jié),夏季的海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的平均帶菌率高達(dá)94.8%[5]。

花蛤、文蛤和蟶味道鮮美且價格實惠,是夏秋季節(jié)最常見的海產(chǎn)食品,也是沿海居民飯桌上常見的菜肴。但近來由副溶血性弧菌引起的海產(chǎn)品中毒報道屢見不鮮,如何更好的預(yù)防和控制副溶血性弧菌引起的食物中毒是食品安全的重要內(nèi)容。分離檢測貝類食品中的可疑副溶血性弧菌并對其鑒定,研究副溶血性弧菌的來源對食物中毒的預(yù)防和控制具有重要的意義。本實驗選擇PCR檢測作為主要的鑒定方法,配合革蘭氏染色、嗜鹽性實驗、3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面實驗和氧化酶實驗,保障實驗結(jié)果的可靠性[6]。從漳州市場采集花蛤、文蛤和蟶樣品進(jìn)行副溶血性弧菌帶菌情況分析,為市民食用水產(chǎn)食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水產(chǎn)樣品 2015年7～10月,從漳州市區(qū)8個市場(新西市場,北橋市場,金峰市場,西洋坪市場,中山橋水產(chǎn)市場,九龍江漁業(yè)碼頭市場,八卦樓漁產(chǎn)市場,古街市場)每月各采集10份樣品,共采集53份花蛤、50份文蛤和42份蟶的新鮮樣品。副溶血性弧菌ATCC 17802和大腸桿菌D5株 由漳州出入境檢驗檢疫局提供。

Tprofessional Thermocycler PCR儀 德國Biometra公司,red 個人型凝膠成像系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司,MIKRO 220R冷凍離心機 德國Hettich公司。

針對副溶血性弧菌的tlh基因設(shè)計上下游引物,上游引物:5′-AAGCGGATT ATGCAGAAGCA-3′,下游引物:5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′ 由上海生工合成;氯化鈉、瓊脂粉、牛肉浸膏、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、TCBS瓊脂培養(yǎng)基 廣州環(huán)凱微生物科技公司;三羥甲基氨基甲烷(tris)、乙酸、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O) 國產(chǎn)分析純;2×Taq Master Mix 上海捷瑞科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無菌采樣 對漳州市區(qū)8個市場的新鮮花蛤、文蛤和蟶隨機抽樣,先用無菌的采樣袋不加運送液密封后,置于冰盒內(nèi)低溫快速運達(dá)實驗室。采樣時間在2015年7～10月,每個攤位每次采樣2～3只鮮活樣品,一次采樣15只。

1.2.2 接種和培養(yǎng) 超凈工作臺預(yù)先紫外滅菌20 min,開啟風(fēng)機,在無菌操作臺內(nèi)點燃酒精燈,將鑷子、剪刀在火焰上滅菌冷卻,找到斧足肌肉外層的內(nèi)臟和瓣鰓,用經(jīng)過酒精燈滅菌的接種環(huán)碰觸肌肉外層,劃在TCBS瓊脂培養(yǎng)基上,于培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h,觀察,并記錄。

1.2.3 可疑菌的純化 待培養(yǎng)18～24 h后的TCBS瓊脂培養(yǎng)基平板上長出淡綠色細(xì)菌,挑出可疑單菌落,劃線于新的TCBS 瓊脂培養(yǎng)基平板上。在培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落。

1.2.4 液體培養(yǎng)基擴菌 在無菌操作臺挑取每個TCBS瓊脂平板中的一個單菌落,接種至液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫?fù)u床180 r/min培養(yǎng)18～24 h,待液體渾濁后留用。

1.2.5 PCR方法初篩副溶血性弧菌 檢測副溶血性弧菌tlh基因,擴增片段長度約為449 bp。水煮法制備模板,擴增體系:25 μL的PCR反應(yīng)體系中含3 μL模板,上下游引物各1 μL,12.5 μL 2×Taq Master Mix(含酶),用去離子H2O補足到25 μL體系。PCR擴增條件為95 ℃,2 min,再按94 ℃,30 s變性、54.5 ℃,60 s退火、72 ℃,45 s延伸,循環(huán)擴增30次后72 ℃,10 min。在 1%的瓊脂糖凝膠上電泳觀察結(jié)果。

1.2.6 嗜鹽性實驗 PCR鑒定陽性的菌株分別接種至0、7%、10% NaCl液體培養(yǎng)基中。恒溫振蕩搖床37 ℃,180 r/min培養(yǎng)18～24 h,觀察并記錄。副溶血性弧菌在0和10%氯化鈉溶液中不生長,在7%氯化鈉溶液中可旺盛生長。

1.2.7 氧化酶實驗 將氧化酶試紙平鋪在潔凈的玻片上(玻片底部用一層白紙墊上易于觀察顏色變化),用移液槍吸取一滴菌液涂布在氧化酶試紙上,如果濾紙在10 s內(nèi)呈現(xiàn)粉紅色或紫紅色,即為氧化酶陽性;不變色為氧化酶陰性。副溶血性弧菌為氧化酶陽性,大腸桿菌為陰性對照。

1.2.8 3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面實驗 超凈工作臺中進(jìn)行3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面穿刺。將試管直立于燒杯中,在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察實驗現(xiàn)象。

1.2.9 統(tǒng)計分析 對不同市場來源的3種樣品中副溶血性弧菌分離率和陽性率進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行χ2檢驗,p<0.05表示差異顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果

漳州的8個市場中分別采集到53份花蛤、50份文蛤和42份蟶的樣品,經(jīng)過TCBS選擇性培養(yǎng)基分別得到37株、45株和36株疑似菌落,分離率分別為69.8%、90.0%和85.7%。在TCBS瓊脂培養(yǎng)基上,挑選藍(lán)綠色單菌落進(jìn)行分離純化,菌落呈圓形、半透明、表面光滑。在細(xì)菌分離約3～5次后,即可觀察到TCBS瓊脂平板上生長的菌落全部為統(tǒng)一的藍(lán)綠色,說明此時細(xì)菌已經(jīng)成功分離純化,見圖1A。接種與分離的過程中,對于無藍(lán)綠色菌落生長的平板,作無害化處理,見圖1B。

圖1 副溶血性弧菌的TCBS分離培養(yǎng)Fig.1 Isolation and culture of Vibrio parahaemolyticus on TCBS medium

2.2 PCR方法鑒定

副溶血性弧菌可在449 bp處檢測出特異條帶。圖2中顯示,樣品1～7號于449 bp處出現(xiàn)特異性條帶,判定為陽性結(jié)果。PCR確定3種水產(chǎn)樣品中副溶血性弧菌陽性率分別為35.8%(19/53)、30.0%(15/50)和54.8%(23/42)。

圖2 PCR擴增出副溶血性弧菌tlh基因的特異片段Fig.2 The specific fragment of Vibrio parahaemolyticus tlh gene by PCR

2.3 革蘭氏染色

將PCR鑒定陽性菌株進(jìn)行革蘭氏染色,顯微鏡下觀察到均為紅色,呈革蘭氏陰性,形態(tài)呈弧狀或短桿狀。革蘭氏染色結(jié)果證明全部符合副溶血性弧菌的革蘭氏陰性特征。

圖3 革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 The result of strain isolated using Gram stain

2.4 嗜鹽性實驗結(jié)果

將PCR鑒定陽性菌進(jìn)行嗜鹽性實驗,所有菌株均在7%氯化鈉液體培養(yǎng)基中生長良好,在0和10%氯化鈉液體培養(yǎng)基中不生長。嗜鹽性實驗結(jié)果證明PCR陽性菌株全部符合副溶血性弧菌嗜鹽性特性。

圖4 嗜鹽性實驗結(jié)果Fig.4 The result of salt tolerance test

圖5 3.5%三糖鐵瓊脂斜面實驗結(jié)果Fig.5 The result of 3.5% sodium chloride three sugar iron agar slant test

2.5 3.5%三糖鐵瓊脂斜面實驗

PCR陽性菌株在3.5%三糖鐵瓊脂試管斜面實驗結(jié)果為:斜面產(chǎn)堿變紅,底層產(chǎn)酸變黃,不產(chǎn)氣,如圖5。根據(jù)副溶血性弧菌的培養(yǎng)特性,在3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面上層產(chǎn)堿為紅色,底層產(chǎn)酸為黃色,無氣泡,不變黑(不產(chǎn)H2S)。3.5%三糖鐵瓊脂斜面實驗結(jié)果表明,分離的PCR陽性菌株均符合副溶血性弧菌的特性。

2.6 氧化酶實驗結(jié)果

將PCR陽性菌液涂布在氧化酶試紙上,10 s內(nèi)均出現(xiàn)紫紅色,表明全部呈現(xiàn)氧化酶陽性,如圖6。

圖6 氧化酶實驗結(jié)果Fig.6 The result of oxidase test注：A,B,C,D是4種副溶血性弧菌分離株的 氧化酶實驗結(jié)果,紫紅色為陽性。

表1 三種貝類產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測結(jié)果

注：表中分離率括號中數(shù)字代表分離疑似菌與樣品數(shù)之比;陽性率括號中數(shù)字代表分子鑒定陽性菌與樣品數(shù)之比。

2.7 統(tǒng)計結(jié)果

漳州市8大市場分離率和陽性率比較差異顯著(p<0.05),同一市場的3種貝類水產(chǎn)品中副溶血性弧菌分離率和陽性率比較差異顯著(p<0.05),本實驗所得數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.8 討論

本實驗采集的53份花蛤、50份文蛤和42份蟶的樣品,經(jīng)過TCBS 選擇性培養(yǎng)基分別得到37株、45株和36株疑似菌落,分離率分別為69.8%、90.0%和85.7%;PCR確定3種水產(chǎn)樣品中副溶血性弧菌陽性率分別為35.8%(19/53)、30.0%(15/50)和54.8%(23/42)(見表1);經(jīng)革蘭氏染色、嗜鹽性實驗、氧化酶實驗和3.5%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面確定PCR檢測的疑似菌均符合副溶血性弧菌的生化和細(xì)菌形態(tài)染色特性,符合率達(dá)100%[7-9]。

因每個市場規(guī)模不同,故在采樣選擇的攤位和樣品數(shù)也因市場規(guī)模大小而有所不同。從分離率和陽性率來看,8個市場來源的樣品中細(xì)菌的分離率達(dá)到40%以上,中山橋市場和九龍江漁業(yè)碼頭市場的分離率最高,達(dá)到100%,西洋坪社區(qū)市場分離率也比較高;而陽性率以九龍江漁業(yè)碼頭市場為最高,達(dá)到50%以上。3種貝類樣品中,文蛤和蟶中副溶血性弧菌的分離率偏高,分別為90%和85.7%;蟶的副溶血弧菌陽性率比花蛤和文蛤分別高出19和24.8個百分點。蟶中副溶血性弧菌污染較為嚴(yán)重,可能與其捕撈環(huán)境衛(wèi)生狀況有關(guān),其高效的富集作用也可使細(xì)菌的攜帶量明顯增加。綜合分析得知,市區(qū)市場中的副溶血性弧菌攜帶率不高,而距離九龍江較近的中山橋和九龍江漁業(yè)碼頭2個市場中陽性率偏高,可能與市場中各種水產(chǎn)品間來源復(fù)雜,且由于缺乏規(guī)范管理而導(dǎo)致交叉污染的幾率增加。從8個市場的調(diào)查和檢測結(jié)果分析,漳州市區(qū)市場在7～10月間所售貝類均有不同程度的副溶血性弧菌污染,陽性率相對較高,市民在食用時需注意衛(wèi)生和安全,充分清洗并徹底加熱后食用,不要生吃或半生食用,以防食源性病原菌直接感染。本實驗樣品為7～10月份平均采集,每個月每種樣品采集10份左右。不同月份間未表現(xiàn)明顯分離率和陽性率差異。分析原因:漳州地區(qū)是亞熱帶海洋氣候,5月份即進(jìn)入夏季,一般每年7～10月份為最炎熱天氣,氣溫基本穩(wěn)定在35 ℃左右,對副溶血性弧菌的分布影響不顯著。

隨著人們生活水平的不斷提高和觀念意識的不斷更新,水產(chǎn)品因其較高的營養(yǎng)價值越來越受廣大消費者的喜愛,并且許多消費者為追求水產(chǎn)食品的鮮美、原滋原味與新穎的烹飪方式喜歡生食水產(chǎn)品[10]。但是生食和食用未熟的海產(chǎn)品都可能引起食物中毒,威脅健康。副溶血性弧菌引起的食物中毒一般多發(fā)于5～11月,高峰季節(jié)在7～9月,有明顯的季節(jié)性,但在外界環(huán)境中容易死亡。當(dāng)溫度為56 ℃時5 min即可將其殺滅,在食醋中只能存活1 min。所以,應(yīng)進(jìn)一步加強這方面衛(wèi)生知識的宣傳與普及,引導(dǎo)市民在食用花蛤及其他水產(chǎn)食品一定要煮熟蒸透,以確保殺死病原微生物,并提倡經(jīng)常食用花蛤的市民蘸取食醋,提高對食物中毒的預(yù)防,減少食品安全隱患。同時,衛(wèi)生監(jiān)督部門應(yīng)重視流通領(lǐng)域和餐飲行業(yè)的衛(wèi)生監(jiān)督,通過宣傳教育有效加強餐飲從業(yè)人員的食品安全意識,從而減少食源性病原菌的污染。

3 結(jié)論

本文分析了漳州市7～10月8大市場的貝類水產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染狀況。結(jié)果表明:距離九龍江水域越近的市場,所售水產(chǎn)品受副溶血性弧菌污染越嚴(yán)重;蟶的副溶血性弧菌陽性率最高,比花蛤和文蛤分別高出19和24.8個百分點。市民食用需嚴(yán)格無害化處理,避免不同種類水產(chǎn)品間的交叉污染。

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Survey of the pollution ofVibrioparahaemolyticusfrom three shellfish products in Zhangzhou City

HU Yuan-qing1,2,ZHOU Zan-hu3,HUANG Yu-rong1,ZHANG Yan-yu1,ZHUANG lei1

(1.School of Biological Science and Biotechnology,Minnan Normal University,Zhangzhou 363000,China;2.Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis,Yangzhou University,Yangzhou 225000,China;3.Comprehensive Technical Service Center,Zhangzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Zhangzhou 363000,China)

To analyze the carrying status ofVibrioparahaemolyticusof shellfish products in Zhangzhou City and provide reference for the food safety problem of shellfish. The fresh sample were collected by sterile operation from 8 markets in Zhangzhou City. The suspected colony was obtained by culturing on TCBS plates and detected using PCR amplification of a specific tlh gene. The positive strain was verified using biochemical test and Gram staining. 53 Venerupis philippinarum,50 Meretrix and 42 Scalprum samples were collected from 8 main markets,37 Venerupis philippinarum,45 Meretrix and 36 Scalprum suspected colony were screening with TCBS selective medium. The separation rate were 69.8%,90.0% and 85.7% forVenerupisphilippinarum,Meretrix and Scalprum,respectively. PCR positive rate were 35.8%(19/53),30.0%(15/50)and 54.8%(23/42). These positive strain were confirmed by Gram staining and biochemical test. The shellfish products in Zhangzhou City are polluted byVibrioparahaemolyticus,seafood should be strictly disposed,to avoid cross contamination between different types of aquatic products.

Vibrioparahaemolyticus;Venerupisphilippinarum;Meretrix;Scalprum;Zhangzhou City

2016-09-06

胡元慶(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：食源性病原微生物控制，食品安全檢測技術(shù)，E-mail:huyuanqing1979@163.com。

福建省自然科學(xué)基金面上項目(26171082)；福建省教育廳A類項目(JA14203)；漳州市自然基金項目(ZZ2014J20)；江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室資助項目(R1402)；國家海洋局海洋生物遺傳資源重點實驗室開放課題(HY1503)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(201610402012)。

TS254.7

A

1002-0306(2017)05-0293-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.047