李 靜,呂曉玲,呂冬雪,王夢姝,趙勝男,趙煥焦

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

頭孢克肟誘導(dǎo)腸道菌群紊亂動物模型的建立

李 靜,呂曉玲*,呂冬雪,王夢姝,趙勝男,趙煥焦

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

目的:構(gòu)建頭孢克肟誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群紊亂模型。方法:將40只體重18～22 g的SPF級BALB/c雌性小鼠隨機分為正常對照組、頭孢克肟低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組10只。灌胃劑量分別為187.75 mg/(kg·d),375.50 mg/(kg·d),563.25 mg/(kg·d),正常對照組灌胃相同劑量的蒸餾水。連續(xù)灌胃7 d后頸椎脫臼處死并收集盲腸內(nèi)容物,采用傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)觀察和分析頭孢克肟對小鼠腸道菌群的影響。結(jié)果:高劑量組小鼠糞便中乳酸桿菌數(shù)量在所選稀釋度下降至30CFU以下,而腸球菌數(shù)量上升至1.26×105CFU,大腸桿菌數(shù)量上升至1.86×106CFU。與空白對照組相比,模型組小鼠腸道菌群總體多樣性和細菌種類顯著降低。結(jié)論:中劑量和高劑量頭孢克肟均能不同程度的誘導(dǎo)小鼠腸道菌群紊亂模型,并且腸道菌群紊亂程度隨灌胃劑量的增加而加重,模型成功建立。

頭孢克肟,腸道菌群,聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)

腸道菌群研究進入大人群時代,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腸道微生物在機體生理活動中扮演著越來越重要的作用,腸道菌群的多樣性和機體健康之間存在著良好的關(guān)聯(lián),包括肥胖、癌癥、自閉癥等在內(nèi)的50多種疾病都與腸道菌群紊亂有關(guān)[1-5]?？股氐闹饕δ苁菍辜毦腥綶6],一旦被濫用就會刺激胃腸系統(tǒng),進而造成腸道菌群紊亂[7]。因此由抗生素引起的腸道菌群紊亂動物模型,常用于對新型微生態(tài)制劑以及食品調(diào)節(jié)腸道菌群功能性的研究。目前模型制備使用的抗生素主要有頭孢曲松[8],氯霉素,阿莫西林[9]等,頭孢曲松和頭孢克肟均為第三代頭孢菌素,藥理作用相同,具有第三代頭孢菌類抗菌譜廣的特性,然而頭孢曲松半衰期約為7～8 h,而頭孢克肟半衰期為3～4 h,半衰期反映了藥物在體內(nèi)的消除速度?？紤]半衰期的不同將會影響其對腸道微生物的作用效果,因此本文利用傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)[10-11]探討不同劑量頭孢克肟對腸道菌群紊亂模型的制備效果,并研究其誘導(dǎo)腸道菌群紊亂動物模型建立的條件,為進一步用于評價食品成分對腸道菌群的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級別,BALB/c雌性小鼠40只,體重18～22 g 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(動物合格證號:SCXK-(軍)2012-0004)。頭孢克肟分散片 廣東先強藥業(yè)股份有限公司;蛋白酶K,溶菌酶,RNaseA,PCR 引物,2×Taq PCR Master Mix,去離子甲酰胺,TEMED,過硫酸胺(APS) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;丙烯酰胺,甲叉雙丙烯酰胺,尿素(分析純);伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、LBS瓊脂培養(yǎng)基、腸球菌瓊脂培養(yǎng)基 青島高科園海波生物技術(shù)有限公司。

Applied Biosystems ProFlexTMPCR儀(ProFlex 3 x 32 well PCR system);凝膠成像系統(tǒng)(Molecular Imager ChemiDocTM XRS+ System);DGGE電泳儀(Bio-Rad,DCodeTM System);Sorvall Legend Micro 17R Centrifuge(上海夏夷實業(yè)有限公司);微型分光光度計(GENEQUANT pro);瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-8C)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物 將40只體重18～22 g的SPF級BALB/c雌性小鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)2 d,隨機分為4組,分別為正常對照組、頭孢克肟低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組10只。根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》[12]計算小鼠的等效劑量,實驗以10倍成人劑量為中劑量,則頭孢克肟劑量組分別為187.75,375.5,563.25 mg/(kg·d),正常對照組灌胃相同劑量的滅菌蒸餾水。在灌胃期間觀察精神狀態(tài),體重變化以及排便情況,對所有實驗小鼠進行促進排便實驗并用高壓滅菌的2 mL EP管及時收集新鮮糞便,立即于-80 ℃凍存。在灌胃最后一天頸椎脫臼處死并測量全小腸、結(jié)腸長度,稱量盲腸重量,同時無菌收集結(jié)盲腸內(nèi)容物。

1.2.2 小鼠糞便活菌記數(shù) 將0.1 g糞便用0.9%生理鹽水進行10倍系列稀釋,選擇2～3個稀釋度分別接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基、Pfizer腸球菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃有氧培養(yǎng)48 h后利用公式計算每克濕便中的菌落數(shù):

其中N為樣品中菌落數(shù)CFU;∑C為菌落數(shù)之和CFU;n1為低稀釋倍數(shù)的菌落個數(shù)CFU;n2為高稀釋倍數(shù)的菌落個數(shù)C;d為稀釋因子即第一稀釋度。

腸道菌群紊亂標(biāo)準:雙歧桿菌和/或乳酸桿菌下降,腸桿菌和/或腸球菌增加,或下降比例低于雙歧桿菌與乳桿菌的下降比例。

1.2.3 腸道細菌微生物區(qū)系的PCR-DGGE分析

1.2.3.1 糞便微生物區(qū)系總DNA的粗提 取100 mg小鼠糞便于2 mL EP管中,加入1 mL PBS(pH7.5,0.1 mol/L)離心得沉淀;加1 mL PBS微離心取上清;離心得沉淀。

1.2.3.2 糞便微生物區(qū)系總DNA的提取 向沉淀中加入0.8 mL溶菌酶pH8.0水浴震蕩1 h;加入10 μL蛋白酶K,0.3 mL PBS,10 uL異戊于65 ℃水浴1 h;加入0.6 mL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)渦旋振蕩10 min,4 ℃ 12000 r/min離心得上清;加入等量的氯仿離心得上清;加入等體積的冷異丙醇冰浴過夜后離心得沉淀;冷乙醇清洗沉淀;加入200 μL TE緩沖液和RNase置于-20 ℃冰箱中保存,用微型分光光度計檢測[13-15]。

1.2.3.3 PCR擴增 本實驗主要是以16SrDNA基因的可變區(qū)V3 區(qū)序列作為靶標(biāo)進行擴增[16]。16S rDNA 基因的可變區(qū)V3區(qū)序列PCR擴增上游引物和下游引物[17]分別為V3-F338-GC和V3-R518。

PCR擴增體系(50 μL):2×Taq PCR Green Mix 25 μL;模板DNA 2 μL;上游引物F(10 μM)1 μL;下游引物R(10 μM)1 μL;ddH2O補充至50 μL。

PCR擴增程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30循環(huán);72 ℃延伸7 min。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并立即進行DGGE電泳實驗。

1.2.3.4 DGGE電泳及染色 聚丙烯酰胺膠濃度為8%(w/v),變性梯度為30%～60%。膠液配置為:15 mL 30%和60%的變性溶液,37 μL的10%過硫酸銨,57 μL的TEMED,混勻,灌膠。電泳條件:200 V,10 min預(yù)電泳;75 V,14 h。電泳完畢后進行EB染色20 min,照膠并用Quantity One分析[18]:香農(nóng)指數(shù)Shannon-Wiener index(H′)=-∑Pi lnPi,Pi 為第i條帶的峰值與該泳道所有條帶峰值總和的比值;均勻度Evenness(E)=H′/H′max,(H′max=ln S(S為豐富度,即DGGE圖譜每條泳道上的條帶數(shù)))。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素頭孢克肟對實驗小鼠的宏觀影響

2.1.1 各受試物對小鼠體重的影響 灌胃前后,頭孢克肟對所有小鼠體重的影響結(jié)果見表1。

表1 各受試物對實驗小鼠體重的影響

通過表1可以看出,與空白對照組相比,造模前各組小鼠的體重沒有顯著差異(p>0.05),說明小鼠屬于隨機分組并且分組具有良好的均衡性。造模后各劑量組與空白對照組相比,小鼠體重沒有顯著性差異(p>0.05),說明抗生素對小鼠體重沒有顯著影響。

2.1.2 受試物對實驗小鼠體征指標(biāo)的影響 灌胃后,受試物對小鼠的盲腸重量、全小腸長度和結(jié)腸長度的影響結(jié)果見表2和圖1。

表2 受試物對實驗小鼠盲腸重量、全小腸長度和結(jié)腸長度的影響

注：**表示與空白對照組比較,有極顯著性差異(p<0.01)。

圖1 空白對照組和抗生素模型組小鼠盲腸Fig.1 The cecums of control mouse and model mouse

通過表2和圖1可以看出,與空白對照組相比,經(jīng)抗生素造模后低劑量組、中劑量組、高劑量組盲腸重量有極顯著差異(p<0.01),說明抗生素使小鼠盲腸極顯著肥大,有研究顯示,無菌小鼠的盲腸明顯肥大,這是由于無菌小鼠腸道菌群缺失導(dǎo)致的,本實驗抗生素組小鼠出現(xiàn)了盲腸肥大并可見盲腸內(nèi)容物稀薄現(xiàn)象,這可能是由維持腸道水分傳輸功能的細菌數(shù)量下降,大量水分滯留于盲腸造成的,表明其腸道菌群的缺失與紊亂。但全小腸長度、結(jié)腸長度在各組間沒有顯著差異。

2.2 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)檢測小鼠腸道菌群結(jié)果

按菌落計數(shù)原則數(shù)出每個糞便樣品的菌落數(shù),可以得到頭孢克肟對小鼠腸道微生物(乳酸桿菌、腸球菌和大腸桿菌)的影響,實驗結(jié)果如表3所示。

表3 受試物對小鼠糞便乳酸桿菌、腸球菌和大腸桿菌的影響

注：ND:未檢測到(<30 CFU);*表示與空白對照組比較,有顯著性差異(p<0.05)。

通過表3可以看出,頭孢克肟低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠腸道中乳酸桿菌的數(shù)量顯著低于正常水平(p<0.05),腸球菌的數(shù)量顯著高于正常水平(p<0.05),高劑量組小鼠大腸桿菌數(shù)量顯著高于正常水平(p<0.05),說明頭孢克肟低中高劑量組均能對小鼠腸道菌群造成一定的影響。

2.3 腸道細菌微生物區(qū)系的 PCR-DGGE分析結(jié)果

2.3.1 腸道細菌微生物區(qū)系總DNA的提取結(jié)果 取1μL溶菌酶法提取得到的DNA片段用微型分光光度計測定其DNA濃度與純度。記錄在260 nm/280 nm處的OD值及濃度,結(jié)果如表4。取3.5 μL DNA加1.5 μL 6×lording buffer用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測結(jié)果如圖2。

表4 DNA純度和濃度檢測結(jié)果

由表4可以看出實驗所提DNA OD260/OD280大部分都在1.8～2.0之間,純度符合要求,只有空白對照組OD值較高,可能有較少的蛋白質(zhì)殘留,但從DNA質(zhì)量濃度和得率來看,較少的蛋白質(zhì)殘留不影響后續(xù)實驗,可進一步實驗。

圖2 糞便細菌總基因組電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of total DNA of fecal microorganism注：正常對照組(1～6),抗生素低劑量組(7～12), 中劑量組(13～18)和高劑量組(19～24)。

由圖2可知,各個泳道上的主條帶清晰且亮度較高,整個泳道上無雜帶和拖尾現(xiàn)象,表明提取效果較好,可以進行后續(xù)實驗。

2.3.2 PCR擴增 利用通用引物338F和518R擴增各組小鼠盲腸內(nèi)容物的16S rDNA V3區(qū)基因。目的條帶片段長度約260 bp(圖3)。

圖3 16S rDNA V3區(qū)基因擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of amplified bacterial 16S rDNA注：正常對照組(1～3),抗生素低劑量組(4～6), 中劑量組(7～9)和高劑量組(10～12)，圖4同。

2.3.3 DGGE結(jié)果 各受試組小鼠總腸道菌群的DGGE圖譜(圖3)顯示,各個泳道均勻性較好,肉眼可見第1～3泳道條帶數(shù)大于4～12泳道條帶數(shù)。因此對DGGE圖譜采用quantity one軟件進行相似性聚類分析,結(jié)果如圖4顯示,正常對照組(1～3)為一類,抗生素模型組(3～12)為一類,如果忽略相對較小的個體差異,頭孢克肟劑量組之間小鼠腸道菌群種類的差異較小。由表5可以看出,中劑量組和高劑量組菌群豐富度與正常對照組有極顯著差異(p<0.01),中劑量組和高劑量組菌群多樣性與正常對照組有顯著差異,各劑量組的菌群均勻性與正常對照組沒有顯著差異。

圖4 糞便細菌的DGGE圖譜Fig.4 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of fecal microorganism

群組豐富度(S)香農(nóng)指數(shù)(H′)均勻性(E)空白對照組1233±088279±034112±015低劑量組900±058211±007091±001中劑量組700±153??176±024?091±002高劑量組733±153??179±015?089±001

注：* 表示與空白對照組比較,有顯著性差異(p<0.05),** 表示與空白對照組比較,有極顯著性差異(p<0.01)。

圖5 小鼠腸道菌群UPGMA相似性聚類分析Fig.5 UPGMA cluster analysis for similarity coefficients of DGGE profile

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)結(jié)果表明,頭孢克肟可以使小鼠糞便中乳酸桿菌數(shù)量顯著降低,腸球菌數(shù)量顯著升高。根據(jù)腸道菌群紊亂標(biāo)準:雙歧桿菌和/或乳桿菌下降,腸桿菌和/或腸球菌增加,或下降比例低于雙歧桿菌與乳桿菌的下降比例可以判斷腸道菌群紊亂,說明腸道菌群失調(diào)動物模型成功建立。PCR-DGGE結(jié)果表明,空白對照組聚為一族,頭孢克肟劑量組聚為一族,中劑量組和高劑量組小鼠腸道菌群總體多樣性和細菌種類顯著降低。PCR-DGGE結(jié)果作為對傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)結(jié)果的補充,可以進一步說明頭孢克肟誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂動物模型成功建立,為評價食品成分對腸道菌群的影響奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

近年來,腸道菌群與健康的關(guān)系已經(jīng)成為當(dāng)前熱門研究領(lǐng)域之一。腸道是人體內(nèi)最大且主要的“免疫器官”,研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群的失衡與機體多種疾病和精神上的疾病密切相關(guān)[19-20]。

本文通過傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)探討不同劑量的頭孢克肟對小鼠腸道菌群的影響。傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果表明頭孢克肟導(dǎo)致腸道主要益生菌數(shù)量下降,而原本不是優(yōu)勢菌群的耐藥腸球菌在藥物處理后得以增殖。PCR-DGGE技術(shù)表明采用溶菌酶法提取得到的糞便微生物基因組達到了預(yù)期效果,可以進行后續(xù)實驗;采用適當(dāng)?shù)臄U增體系和擴增程序?qū)蚪M中16SrDNA片段進行PCR擴增,對擴增產(chǎn)物進行DGGE實驗,結(jié)果表明使用不同劑量的頭孢克肟作用小鼠后,各劑量組條帶的豐度和亮度與正常對照組相比有顯著差異,但劑量組之間的條帶豐度沒有顯著差異。

PCR-DGGE的結(jié)果作為對傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果的補充,證實了小鼠腸道菌群在頭孢克肟的長時間作用下發(fā)生了紊亂,使小鼠糞便中乳酸桿菌數(shù)量顯著降低,腸球菌數(shù)量顯著升高,并且腸道菌群的種類和數(shù)量明顯降低。中劑量組和高劑量組均成功誘導(dǎo)出小鼠腸道菌群紊亂模型,因此可以將中劑量頭孢克肟(375.5 mg/(kg·d))誘導(dǎo)腸道菌群紊亂動物模型用于新型微生態(tài)制劑以及食品調(diào)節(jié)腸道菌群功能性的研究。

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Establishment of mice model for intestinal dysbacteria induced by cefixime dispersible tablets

LI Jing,LV Xiao-ling*,LV Dong-xue,WANG Meng-shu,ZHAO Sheng-nan,ZHAO Huan-jiao

(College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science& Technology,Tianjin 300457,China)

Objective:To produce the mouse models of intestinal dysbacteria which induced by cefixime dispersible tablets. Methods:female SPF grade BALB/c 36,weight 18～22 g,intestinal dysbiosis mice treated with cefixime dispersible tablets,low dose(187.75 mg/(kg· d)),medium dose(375.5 mg/(kg·d))and high dose(563.25 mg/(kg·d)). Control mice received sterile deionized water by oral gavage. On the 8th day,the mice were euthanized by cervical dislocation. The caecum contents were collected in a sterile 2 mL centrifuge tube. Compare the shift in the intestinal microbial by vital cell counting and polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE)analysis. Result:TheEnterococcusandE.coliwere promoted andLactobacilluswas suppressed. The reduction of diversity and abundance was shown in middle and higher doses group. Conclusion:The model of intestinal dysbacteria builded successfully.

cefixime dispersible tablets;intestinal microflora;polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE)

2016-09-09

李靜(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品添加劑與功能配料，E-mail:marissa19910204@163.com。

*通訊作者:呂曉玲(1960-)，女，碩士，教授，主要從事食品添加劑與功能配料的研究，E-mail:lxling@tust.edu.cn。

國家科技支撐計劃項目(2011BAD23B02)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)05-0361-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.060