李慧萍，曹帥，王恩陽，朱向情，尹娜，魏玲* ，潘興華*

(1昆明總醫(yī)院地方干部病房，昆明650032;2云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明650032)

心臟重構(gòu)(cardiac remodeling)是各種病理因素引起心力衰竭及心房顫動(dòng)的共同病理機(jī)制［1］，心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡在心臟重構(gòu)中起著重要作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，可以在特定的環(huán)境下分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，而且能分泌多種細(xì)胞因子，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少基質(zhì)膠原沉積［2，3］。Klotho基因是新近發(fā)現(xiàn)的抗衰老基因，具有抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡［4］和抑制心肌纖維化等作用［5］。本研究建立了SD大鼠慢性缺氧心臟重構(gòu)的模型，體外培養(yǎng)BMSCs和重組慢病毒介導(dǎo)Klotho基因，通過尾靜脈移植至慢性缺氧心臟重構(gòu)大鼠體內(nèi)，探討B(tài)MSCs和Klotho基因移植對(duì)慢性缺氧大鼠心臟重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1．1 分組和模型建立

SPF級(jí)的雄性SD大鼠30只［許可證號(hào):SCXK(滇)2011-0004］，10周齡。所有SD大鼠的實(shí)驗(yàn)操作過程都遵循國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理?xiàng)l例和管理實(shí)施細(xì)則。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(n=6)、模型組(n=8)、BMSCs組(n=8)和 Klotho組(n=8)。正常對(duì)照組不給予缺氧處理，同時(shí)用于提取BMSCs。其余各組放入缺氧箱中［6］，設(shè)置氧濃度為10%，持續(xù)缺氧28 d，造模期間大鼠共死亡7只，剩余模型組5只、BMSCs組6只、Klotho組6只。造模結(jié)束后，將BMSCs通過尾靜脈注射方式以每只5×106/ml移植至慢性缺氧模型大鼠體內(nèi)，即BMSCs組，4周后麻醉取材;將Klotho基因按照1×109TU/ml移植至模型大鼠體內(nèi)，即Klotho組，4周后麻醉取材。

1．2 BMSCs的體外分離培養(yǎng)、鑒定及在心肌中的定位

采用貼壁分離法進(jìn)行培養(yǎng)，在37℃、飽和濕度和5%CO2條件下分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，取第3代BMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行成脂誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)，用油紅O和茜素紅工作液染色。鑒定脂滴的形成和鈣結(jié)節(jié)［7］。以流式細(xì)胞儀鑒定 BMSCs的表面標(biāo)志CD34、CD44 和 CD90。

將慢病毒介導(dǎo)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)染至BMSCs進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過尾靜脈注射移植5×106/ml至大鼠體內(nèi)，4 d后摘除心臟，冰凍切片觀察BMSCs在心肌中的分布。

1．3 心肌中Klotho mRNA的表達(dá)

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)檢測各組大鼠心肌中Klotho mRNA的表達(dá)。Trizol法提取BMSCs的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書取1μg RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以cDNA為模板，擴(kuò)增目的片段。PCR引物由上海生工生物有限公司合成。PCR結(jié)束后獲取 Ct值，并計(jì)算 2－△△Ct，分析表達(dá)差異。Klotho上游和下游引物分別為5’-CAATGGCTTCCCTCCTTTACCT-3’和 5’-TTCTCTTCTTGGCTACAACCCC-3’。GAPDH上游和下游引物分別為5’-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3’和 5’-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3’。

1．4 心肌細(xì)胞中膠原濃度的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測各組大鼠血清、心肌中Ⅰ型前膠原羥基端肽(procollagenⅠC-propeptide，PⅠCP)、Ⅲ型前膠原羥基端肽(procollagenⅢ C-propeptide，PⅢCP)濃度，用標(biāo)準(zhǔn)物和吸光度(A)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的多項(xiàng)式二次回歸方程，將樣品的A值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1．5 心肌組織學(xué)檢測

采用HE染色、MASSON染色和Tunel檢測，并在鏡下觀察變化。應(yīng)用Image-pro plus 6．0軟件計(jì)算MASSON染色藍(lán)色膠原纖維占整個(gè)組織面積的比率，即心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。計(jì)算Tunel檢測中凋亡細(xì)胞數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)量的百分比，即為心肌細(xì)胞凋亡率。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 BMSCs的培養(yǎng)和鑒定

培養(yǎng)48 h可見短小梭形的BMSCs貼壁生長，原代細(xì)胞約10 d達(dá)90%以上融合，細(xì)胞為均一分布漩渦狀排列的長梭形細(xì)胞群。傳代后細(xì)胞增殖時(shí)間縮短，平均5 d達(dá)85%以上融合。分別用成脂、成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化BMSCs，以證明其具有多向分化性:成脂誘導(dǎo)后用油紅O染色，使脂滴呈橘紅色;成骨誘導(dǎo)后用茜素紅染色，使成骨鈣結(jié)節(jié)被染成深紅色(圖1)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，BMSCs的表面抗原CD44(99.8%)和CD90(99.7%)表達(dá)呈陽性，CD34(0.5%)等表達(dá)呈陰性，說明培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞為BMSCs。慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染的BMSCs在大鼠心肌的分布情況如圖2所示。

圖1 BMSCs分化染色結(jié)果Figure 1 Staining results of differentiation of BMSCs(×100)BMSCs:bone marrow mesenchymal stem cells

圖2 大鼠心肌冰凍切片的熒光顯微鏡結(jié)果Figure 2 Fluorescence microscopy for frozen sections of rat myocardium(GFP×20)

2．2 各組大鼠心肌中Klotho mRNA表達(dá)的比較

正常對(duì)照組、模型組和Klotho組中Klotho mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(1．80 ±0．53)、(0．78 ±0．14)和(4．86±0．61)。與正常對(duì)照組相比，模型組的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而Klotho組的相對(duì)表達(dá)量顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

2．3 各組大鼠PⅠCP和PⅢCP濃度的比較

無論在心肌還是血清中，與正常對(duì)照組比較，模型組、BMSCs組和Klotho組中PⅠCP和PⅢCP的濃度均顯著升高(P＜0．01);而與模型組比較，BMSCs組和Klotho組中PⅠCP和PⅢCP的濃度均顯著降低(P ＜0．01;表1)。

2．4 HE和MASSON染色及各組大鼠CVF的比較

HE染色顯示，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞呈短柱狀，細(xì)胞核呈橢圓形、深染(圖3A);模型組心肌細(xì)胞水腫，組織局灶性壞死并伴炎性細(xì)胞浸潤，局部可見帶狀纖維化(圖3C);Klotho組仍有大量壞死灶及炎性細(xì)胞(圖3E);BMSCs組仍有少量聚集的壞死炎性細(xì)胞(圖3G)。MASSON染色后膠原纖維呈藍(lán)色，肌肉和纖維素呈紅色。正常對(duì)照組心肌間質(zhì)膠原成分極少(圖3B);模型組心肌膠原成分大量增多，膠原纖維互相連接成網(wǎng)狀，排列紊亂(圖3D);Klotho組(圖3F)和BMSCs組(圖3H)心肌膠原成分明顯減少，主要分布于血管及心肌間隙較大的部位。正常對(duì)照組、模型組、Klotho組和 BMSCs組的 CVF分別為(0.06±0.03)%、(33.51±10.66)%、(8.13±4.94)%和(7．55±2．18)%。與正常對(duì)照組相比，模型組、Klotho組和BMSCs組的CVF均顯著升高(P＜0.01);與模型組相比，Klotho組和BMSCs組的CVF均顯著降低(P ＜0．01)。

2．5 心肌組織切片Tunel檢測及心肌細(xì)胞凋亡率

DAPI將所有細(xì)胞核染色，在紫外激發(fā)下呈藍(lán)色;FITC熒光素將凋亡細(xì)胞核標(biāo)記，在綠光激發(fā)下呈綠色(圖4)。正常對(duì)照組、模型組、BMSCs組和Klotho組的心肌細(xì)胞凋亡率分別為(0．12±0．05)%、(67．72 ±10．73)%、(10．19 ±2．03)%和(32．43 ±2．74)%。與正常對(duì)照組相比，模型組、BMSCs組及Klotho組的心肌細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P＜0．01);與模型組相比，BMSCs組和Klotho組的心肌細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P＜0．01);與Klotho組相比，BMSCs組的心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0．01)。

表1 各組大鼠PⅠCP和PⅢCP濃度的比較Table 1 Comparison of PⅠCP and PⅢCP contents among groups(pg/ml±s)

表1 各組大鼠PⅠCP和PⅢCP濃度的比較Table 1 Comparison of PⅠCP and PⅢCP contents among groups(pg/ml±s)

PⅠCP:procollagenⅠ C-propeptide;PⅢCP:procollagenⅢ C-propeptide;BMSCs:bone-marrow mesenchymal stem cells．Compared with control group，＊＊P ＜0．01;compared with model group，##P ＜0．01

Group n PⅠCP PⅢCP Serum Myocardium Control 6 568．97 ±63．08## 787．51 ±85．80## 312．47 ±63．97## 470．45 ±47．92 Serum Myocardium##Model 5 2487．73 ±19．38＊＊ 2790．01 ±16．15＊＊ 1518．21 ±36．14＊＊ 1591．09 ±10．26＊＊Klotho 6 1514．26 ±31．34＊＊## 1763．04 ±35．41＊＊## 906．54 ±26．15＊＊## 1092．64 ±24．73＊＊##BMSCs 6 1406．56 ±23．34＊＊## 1463．02 ±24．46＊＊## 826．54 ±26．85＊＊## 992．64 ±27．66＊＊##

圖3 心肌組織HE和MASSON染色Figure 3 HE staining and MASSON staining of myocardium tissue(×400)

圖4 Tunel檢測結(jié)果Figure 4 Results of Tunel detection(×400)

3 討論

心臟重構(gòu)是以心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡為特征的病理表現(xiàn)，是各種病理因素引起心力衰竭及心房顫動(dòng)的共同病理機(jī)制［1］。研究發(fā)現(xiàn)［8，9］，BMSCs及抗衰老基因(Klotho基因)均能有效改善心功能。

BMSCs存在于骨髓中，具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，移植到心臟組織后，由于其獨(dú)有的歸巢和修復(fù)能力，可定向分化為心肌細(xì)胞以替代受損者。研究顯示，BMSCs移植在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎心肌梗死模型中可使心功能得到不同程度的改善［8］，并認(rèn)為其可能的機(jī)制包括:BMSCs分化為心肌細(xì)胞參與了宿主心臟的收縮、通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)缺血區(qū)血管新生、抑制心臟重構(gòu)等。在BMSCs移植心力衰竭大鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)［10］，移植后能降低心肌中Ⅰ、Ⅱ型膠原沉積，降低基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，改善心功能。且隨著BMSCs移植數(shù)量的增加，梗死心肌中病理性膠原纖維的沉積量可逐漸減少，有利于梗死心臟結(jié)構(gòu)功能的改善［12］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似:BMSCs移植至慢性缺氧心臟重構(gòu)大鼠體內(nèi)4周后，大鼠血清和心肌中的PⅠCP和PⅢCP濃度較模型組顯著降低，心肌中CVF和心肌細(xì)胞凋亡率較模型組顯著降低。提示BMSCs移植可以逆轉(zhuǎn)心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)的作用。也有實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs移植在受損心肌中會(huì)分化為其他細(xì)胞。因此，BMSCs移植改善心功能的作用雖然已被證實(shí)，但其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

Klotho基因是具有抗衰老作用的基因，Klotho基因敲除的小鼠會(huì)表現(xiàn)出與人類神經(jīng)系統(tǒng)衰老類似的表現(xiàn)，而過表達(dá)Klotho蛋白可以改善衰老癥狀，延長小鼠的壽命［13］。Song 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射Klotho蛋白能夠抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡，阻止心肌重構(gòu)的發(fā)生。劉其峰等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)輸尿管梗阻腎病大鼠模型體內(nèi)腹腔注射Klotho基因，能夠顯著減輕大鼠腎間質(zhì)纖維化。李莎莎等［14］也發(fā)現(xiàn)，Klotho基因可以抑制腎臟細(xì)胞凋亡和減輕腎臟纖維化。本實(shí)驗(yàn)采用重組慢病毒介導(dǎo)Klotho基因，將其移植在心臟重構(gòu)大鼠體內(nèi)4周后，大鼠血清和心肌中的PⅠCP及PⅢCP濃度較模型組均顯著降低，心肌中CVF和心肌細(xì)胞凋亡率較模型組顯著減少。提示Klotho基因移植可以逆轉(zhuǎn)心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)的作用，但其具體的作用機(jī)制還需要深入研究。

本研究結(jié)果顯示，與Klotho組相比，BMSCs組的心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0．01)。我們推測可能是因?yàn)锽MSCs通過靜脈移植可以歸巢在心肌中，并具有分化成心肌細(xì)胞替代凋亡細(xì)胞的作用，而Klotho基因則不具備這一項(xiàng)功能。但Klotho基因可以調(diào)節(jié)離子通道及多種信號(hào)通路［15］，因此我們?cè)O(shè)想其逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)的作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)離子通道和信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。提示我們將Klotho轉(zhuǎn)染至BMSCs或許對(duì)心臟重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)效果更佳，這將是我們進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

綜上所述，BMSCs和Klotho基因移植均具有逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)的作用，二者在減輕心肌纖維化方面無顯著差異，在抑制心肌細(xì)胞凋亡方面，BMSCs移植較Klotho基因移植效果更顯著。但二者發(fā)揮逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

［1］Li X，Han J，Li L，et al．Effect of farnesyltransferase inhibition on cardiac remodeling in spontaneously hypertensive rats［J］．Int J Cardiol，2013，168(4):3340 － 3347．DOI:10．1016/j．ijcard．2013．04．038．

［2］Mazo M，Arana M，Pelacho B，et al．Mesenchymal stem cells and cardiovascular disease:a bench to bedside roadmap［J］．Stem Cells Int，2012，2012:175979．DOI:10．1155/2012/175979．

［3］Narita T，Suzuki K．Bone marrow derived mesenchymal stem cells for the treatment of heart failure［J］．Heart Fail Rev，2015，20(1):53 －68．DOI:10．1007/s10741-014-9435-x．

［4］Banerjee S，Zhao Y，Sarkar PS，et al．Klotho ameliorates chemically induced endoplasmic reticulum(ER)stress signaling［J］．Cell Physiol Biochem，2013，31(4－5):659－672．DOI:10．1159/000350085．

［5］賈政，魏玲，劉茜．重組腺病毒介導(dǎo)Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)大鼠心力衰竭心肌重構(gòu)的影響［J］．中華心血管病雜志，2015，43(3):219 －226．DOI:10．3760/cma．j．issn．0253-3758．2015．03．008．Jia Z，Wei L，Liu Q．Impact of transfection with recombinant adenovirus vector-mediated Klotho gene on myocardial remodeling in a rat model of heart failure［J］．Chin JCardiol，2015，43(3):219 － 226．DOI:10．3760/cma．j．issn．0253-3758．2015．03．008．

［6］林夢嬌，田倪妮，魏玲，等．慢性缺氧大鼠心肌HSP47 mRNA的表達(dá)及其與PⅠCP和PⅢNP含量的相關(guān)性研究［J］．中華老年多器官疾病雜志，2017，16(4):288－292．DOI:10．11915/j．issn．1671-5403．2017．04．067．Lin MJ，Tian NN，Wei L，et al．Myocardial HSP47 mRNA expression and its correlation with serum PⅠCP and PⅢNP contents in rats under chronic hypoxic condition［J］．Chin J Mult Organ Dis Elderly，2017，16(4):288 －292．DOI:10．11915/j．issn．1671-5403．2017．04．067．

［7］閔敏，張雪靜，馬紅，等．人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及體外成骨成脂誘導(dǎo)分化［J］．江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013，23(3):185－190．Min M，Zhang XJ，Ma H，et al．Osteogenic differentiation of primary cultured human adipose-derived mesenchymal stem cells accompanying adipogenic differentiation in vitro［J］．J Jiangsu Univ(Med Ed)，2013，23(3):185－190．

［8］Krause U，Harter C，Seckinger A，et al．Intravenous delivery of autologous mesenchymal stem cells limits infarct size and improves left ventricular function in the infarcted porcine heart［J］．Stem Cells Dev，2007，16(1):31－37．

［9］Song S，Gao P，Xiao H，et al．Klotho suppresses cardiomyocyte apoptosis in mice with stress-induced cardiac injury via downregulation of endoplasmic reticulum stress［J］．PLoS One，2013，8(12):e82968．DOI:10．1371/journal．pone．0082968．

［10］Li L，Zhang Y，Li Y，et al．Mesenchymal stem cell transplantation attenuates cardiac fibrosis associated with isoproterenolinduced global heart failure［J］．Transplant Int，2008，21(12):1181－1189．DOI:10．1016/0009-2509(94)00195-W．

［11］Dixon JA，Gorman RC，Stroud RE，et al．Mesenchymal cell transplantation and myocardial remodeling following myocardial infarction［J］．Circulation，2009，120(11 Suppl):S220 －S229．DOI:10．1161/CIRCULATIONAHA．108．842302．

［12］Chang R，Li Y，Yang X，et al．Protective role of deoxyschizandrin and schisantherin A against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats［J］．PLoS One，2013，8(4):e61590．DOI:10．1371/journal．pone．0061590．

［13］劉其鋒，葉建明，李莎莎．Klotho抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)減輕UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2015，16(3):203－206．Liu QF，Ye JM，Li SS．Klotho alleviates renal interstitial fibrosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in UUO rats［J］．Chin JIntegr Trad West Nephrol，2015，16(3):203 －206．

［14］李莎莎，鄧志勇，何敖林，等．Klotho對(duì)CsA慢性腎毒性大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的影響［J］．生命科學(xué)研究，2015，19(5):422－425．Li SS，Deng ZY，He AL，et al．Klotho ameliorates cyclosporineinduced chronic nephrotoxicity via inhibition of endoplasmic reticulum stress［J］．Life Sci Res，2015，19(5):422 － 425．