王 玲,李 鵬,姜 琦

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 眼科，吉林 長春130033;2.吉林大學南嶺校區(qū) 工程力學系，吉林 長春130022;3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 腎病科，吉林 長春130033)

以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等干預視神經(jīng)損傷大鼠視神經(jīng)應力松弛特性分析

王 玲1,李 鵬2,姜 琦3*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 眼科，吉林 長春130033;2.吉林大學南嶺校區(qū) 工程力學系，吉林 長春130022;3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 腎病科，吉林 長春130033)

視神經(jīng)損傷是以藥物治療、手術治療，還是以糖皮質激素治療，仍存在著較大的爭議[1]。近期視神經(jīng)損傷以干細胞移植治療已在動物實驗中取得了一定的進展[2]。干細胞移植治療視神經(jīng)損傷很可能成為一條嶄新的途徑[1]。關于以人臍血干細胞hUCBSC(human umbilical cord blood stem cells)干預治療視神經(jīng)損傷，周丹[3]以人臍血干細胞干預治療大鼠外傷性視神經(jīng)部分損傷進行了研究，得出了聯(lián)合使用人臍血干細胞和神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進神經(jīng)傳導功能恢復的作用，神經(jīng)營養(yǎng)因子、人臍血干細胞、神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合人臍血干細胞對大鼠外傷性視神經(jīng)部分損傷后視神經(jīng)傳導功能的恢復具有促進作用的結論。Zhao和Gluckman等[4,5]的研究結果表明，通過向動物眼玻璃體腔注射hUCBSC 可以在一定程度上起到修復TON,減緩RGC 進行性死亡，減少視功能喪失的作用。李云琴等[1]觀察了以人臍血干細胞hUCBSC干預視神經(jīng)損傷動物模型后的效果， 研究發(fā)現(xiàn)，以人臍血干細胞移植后，對SD 大鼠部分受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞( retinal ganglion cells，RGC) 具有保護的作用，得出了向視神經(jīng)損傷大鼠玻璃體腔注射hUCBSC 可減緩視網(wǎng)膜中RGC 的凋亡，對RGC 具有一定的保護作用的結論。

關于人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子干預治療視神經(jīng)損傷動物模型，劉勇等[6]對-綠色熒光蛋白(GFP)基因神經(jīng)干細胞、轉染人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain—derived neurotrophic factor，hBDNF)干預視神經(jīng)損傷大鼠hBDNF、 GFP在視網(wǎng)膜內(nèi)的存活、遷移和分化情況和對視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)存活的影響進行了研究，得出了移植后的hBDNF—GFP—NSCs可少數(shù)可分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞；還可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞，移植hBDNF—GFP—NSCs可以增加RGCs的存活數(shù)17的結論。關于視神經(jīng)動物模型以藥物治療后的生物力學實驗研究，Jiang等[7]復制家兔視神經(jīng)損傷模型，分別以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、以中藥復光顆粒、重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合中藥復光顆粒進行干預治療后取各組視神經(jīng)進行拉伸實驗，結果表明，中藥復光顆粒、重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、中藥復光顆粒聯(lián)合重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預組拉伸力學性能指標均大于視神經(jīng)損傷模型組，差異顯著(P<0.05).得出了視神經(jīng)損傷模型以重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、中藥復光顆粒、中藥復光顆粒聯(lián)合重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子干預治療后，動物視神經(jīng)的拉伸力學性能指標均有一定的恢復的結論。對視神經(jīng)損傷動物模型以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、人臍血干細胞干預治療后視神經(jīng)的應力松弛分析鮮有報道，鑒于視神經(jīng)損傷治療的需要，本實驗分別以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和人臍血干細胞干預治療視神經(jīng)損傷動物模型后進行應力松弛實驗，以應力松弛特性指標研判人臍血干細胞、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子干預治療視神經(jīng)損傷大鼠的療效，旨在為臨床治療視神經(jīng)損傷提供應力松弛力學特性參數(shù)。

1 材料與方法

實驗大鼠：6月齡雄性SD大鼠60只,體質量320-330 g，購于吉林大學實驗動物部。實驗前通過腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg麻醉大鼠，檢查大鼠外眼及眼底有無病變，對無病變大鼠納入實驗。動物飼養(yǎng)室溫度22-25℃，自然光照，每天光照12小時，室內(nèi)空氣流通，相對濕度58-71%，大鼠在籠中自由攝食飲水。60只大鼠隨機分為視神經(jīng)損傷以BDNF干預組20只，視神經(jīng)損傷模型組20只、視神經(jīng)損傷模型以人hUCBSC干預組20只，在各組大鼠中隨機取20只大鼠正常眼(右眼)為正常對照組。

藥物：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，上海酶聯(lián)生物科技有限公司(上海，中國)人臍血干細胞(hUCBSC)，深圳北科生物公司生產(chǎn)(深圳，廣東省，中國)。

大鼠視神經(jīng)損傷模型的復制：按參考文獻[7]的方法復制大鼠視神經(jīng)損傷模型，將大鼠俯臥位固定于手術臺上,向大鼠腹腔內(nèi)注射0.1%的烏拉坦(5 mg/kg)水合氯醛麻醉大鼠,之后將大鼠左眼頂側眶上皮膚切開，露出頂側眶、眶壁和眶上緣切跡頂側眶,切除眶上緣切跡兩側部分眶壁骨板(寬5 mm，深7-8 mm),將后部眼球筋膜剪開,沿上直肌向球后鈍性分離,暴露眼球后視神經(jīng)。在離后極部約3 mm，游離視神經(jīng)約5 mm,用相當于98 g恒定壓力的反向血管夾(型號：W40160，規(guī)格：3.7 cm；上海醫(yī)療器械廠(上海，中國) 鉗夾同一部位的視神經(jīng)5 s。術野用慶大霉素液沖洗5次后，以,青島耐克醫(yī)材有限公司(青島，山東省，中國)生產(chǎn)的10-0號尼龍線分層縫合。造模后立即觀察,對光反射消失,傷眼瞳孔散大，視網(wǎng)膜血管無出血或梗塞大鼠作為造模成功的動物納入實驗。

藥物干預：對視神經(jīng)損傷大鼠以人臍血干細胞(hUCBSC)干預組大鼠于造模7天后，用注射器向大鼠玻璃體內(nèi)一次性注射hUCBSC106個[7]。對視神經(jīng)損傷模型以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)干預組大鼠于造模7天后[7]，用注射器向大鼠玻璃體內(nèi)一次性注射BDNF50 ng。

各組大鼠視覺電生理檢測：各組大鼠于造模后即刻和造模30d后以REFZ-POZE21sompace型視覺電生理儀(德國、慕尼黑)檢測各組大鼠的閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)指標，參考電極置于額部正中，記錄電極放于枕骨結節(jié)上1.5-2.0 cm處，將參考皮膚電極放置在眼眶顳側，將接地電極放置在耳垂；將角膜接觸鏡電極放好，電極放好后開始刺激，閃光照度2 擋，60lx，頻率2Hz，分析時間250 ms。

各組大鼠視覺電生理檢測完成后，以耳緣靜脈注氣法處死各組大鼠，使視神經(jīng)暴露，在蘇州六六科技股份有限公司(蘇州，江蘇省，中國)生產(chǎn)的YZ6F直接檢眼鏡下以手術刀切取大鼠眶內(nèi)段同一部位視神經(jīng)，放在裝有生理鹽水的容器內(nèi)，存放于4℃冰箱內(nèi)。

大鼠視神經(jīng)試樣應力松弛實驗： 以CCs-3型讀數(shù)顯微鏡(長春市第三光學儀器廠)測量視神經(jīng)試樣的幾何尺寸，試樣長度為10 ±0.1 mm，視神經(jīng)損傷模型以hUCBSC干預組試樣直徑0.79-0.82 mm、正常對照組試樣直徑0.78-0.82 mm，視神經(jīng)損傷模型組試樣直徑0.76-0.81 mm、 視神經(jīng)損傷模型以BDNF干預組試樣直徑00.780-81 mm mm。按參考文獻[8]的方法分別對每個試樣進行預調(diào)處理后待用。應力松弛實驗溫度設定為36.5±1.0℃，將試樣裝夾在MODEL55100型電子萬能試驗機(長春試驗機研究所生產(chǎn))的夾具內(nèi)，以60%/min的速度對試樣進行應力松弛實驗，當各組大鼠視神經(jīng)試樣應力為0.386 Mpa，視神經(jīng)損傷模型組試樣應變?yōu)?.86%、正常對照組試樣應變?yōu)?.14%、視神經(jīng)損傷模型以BDNF干預組試樣應變?yōu)?.94%、視神經(jīng)損傷模型以hUCBSC干預組試樣應變?yōu)?.06%時保持應變恒定，應力松弛實驗時間為7 200 s。達到7 200 s時，計算機自動輸出應力松弛實驗結果。實驗中不斷的向試樣淋生理鹽水，以使試樣保持濕度。

統(tǒng)計學分析方法：以美國SPSS16.0 軟件包(SPSS,Chicago,IL,USA)對視神經(jīng)試樣應力松弛實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以mean±SD表示，采用Sceffe法和單因素方差分析法比較組間數(shù)據(jù)差異，P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 各組大鼠閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)檢測結果

各組大鼠視神經(jīng)閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)檢測結果見表1。

表1 各組大鼠視神經(jīng)閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)檢測結果(n=20)

注:造模30天后各組比較：與模型組比較aP<0.05,與hUCBSC干預組比較，bP<0.05。

F- VEP 記錄 圖形分析標準: P1 波幅值為自N1 波谷底至P1 波峰頂,潛伏期為自觸發(fā)時至P1峰為止。

2.2 以計算機擬合的視神經(jīng)試樣應力松弛實驗曲線

以計算機擬合的視神經(jīng)試樣應力松弛實驗曲線見圖1.

圖1 以計算機擬合的大鼠視神經(jīng)應力松弛實驗曲線

視神經(jīng)應力松弛實驗結果顯示，BDNF干預組hUCBSC干預組大鼠視神經(jīng)的7 200 s應力下降量大于模型組大鼠視神經(jīng)的7 200 s應力下降量(P<0.05)，以hUCBSC干預組大鼠視神經(jīng)的7 200 s應力下降量大于以BDNF干預組鼠視神經(jīng)的7 200 s應力下降量(P<0.05)，各組大鼠視神經(jīng)試樣的應力松弛曲線的函數(shù)表達關系均是以對數(shù)關系變化的。

3 討論

通過電生理檢測判斷視神經(jīng)損傷恢復效果是一種重要的檢測方法。各組大鼠視神經(jīng)電生理檢測結果表明，模型組大鼠視神經(jīng)峰值電壓小于視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預治療組和以hUCBSC干預治療組(P<0.05)，模型組大鼠峰潛時值大于視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預治療組和以hUCBSC干預治療組(P<0.05)，視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預治療組Pl峰值電壓小于視神經(jīng)損傷動物模型以hUCBSC干預治療組(P<0.05)。

各組大鼠視神經(jīng)應力松弛實驗結果顯示，視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預組和以hUCBSC干預組大鼠視神經(jīng)的7200s應力下降量大于視神經(jīng)損傷動物模型組(P<0.05)，視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預組7200s應力下降量小于以hUCBSC干預組 (P<0.05)，各組大鼠視神經(jīng)試樣的應力松弛曲線均以對數(shù)函數(shù)關系變化，視神經(jīng)損傷后改變了視神經(jīng)的應力松弛特性。

大鼠視神經(jīng)電生理、應力松弛檢測結果證明，視神經(jīng)損傷模型大鼠以BDNF、hUCBSC干預治療后，對視神經(jīng)損傷模型大鼠電生理指標、應力松弛特性指標具有恢復的作用，說明視神經(jīng)損傷模型大鼠通過以BDNF神經(jīng)營養(yǎng)因子、人臍血干細胞(hUCBSC)干預治療，具有一定的療效，以hUCBSC的干預治療神經(jīng)損傷模型大鼠的效果更好。

視神經(jīng)為粘彈性生物材料，粘彈性生物材料的粘彈性的表現(xiàn)形式主要為蠕變和應力松弛，視神經(jīng)的應力松弛特性是視神經(jīng)承受應變適應性的反應。視神經(jīng)的應力松弛特性是為了適應其生理功能需要而存在的，視神經(jīng)正常范圍的應力松弛力學特性有利于抵抗恒變形對視神經(jīng)的傷害，完整結構的視神經(jīng)應力松弛特性有利于視神經(jīng)的生理功能需。分析認為，大鼠視神經(jīng)損傷后，纖維結構紊亂、排列發(fā)生了改變，對應力松弛特性產(chǎn)生了影響。視神經(jīng)損傷通過以hUCBS、BDNF干預治療后視神經(jīng)的應力松弛特性得到了一定的恢復。

Chen等[10]對視神經(jīng)損傷動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，在動物玻璃體腔內(nèi)注入BDNF，1周后視網(wǎng)膜存活的RGCs比例增高，得出了視神經(jīng)損傷動物模型以BDNF干預治療有一定的效果，RGCs具有保護軸突作用的結論。大量的研究結果表明，外源性供給BDNF及GDNF可很好的改善節(jié)細胞的存活率,促進節(jié)細胞軸突再生[11]。本實驗結果支持參考文獻[11]視神經(jīng)損傷模型動物通過BDNF干預治療可改善視神經(jīng)節(jié)細胞的存活率,促進節(jié)細胞軸突再生的觀點，

臍血作為干細胞的重要來源，廣泛的應用于修復神經(jīng)損傷的臨床及基礎研究中，臍血間充質干細胞對神經(jīng)損傷修復的機制尚未完全搞清楚，分析認為，其作用機理系由于在局部微環(huán)境的刺激下，干細胞通過自分泌的形式產(chǎn)生各種細胞因子向受損組織分化并替代受損細胞，與周圍細胞建立聯(lián)系促進神經(jīng)功能的恢復[12-14]。

以往以藥物干預治療視神經(jīng)損傷動物的效果以電生理測試、觀察組織形態(tài)等研究居多[1]。本實驗與以往研究的區(qū)別是，對比分析了對視神經(jīng)損傷模型大鼠、視神經(jīng)損傷模型大鼠以BNTF、以hUCBSC干預治療后視神經(jīng)的應力松弛特性，以歸一化分析的方法的方法處理各組大鼠視神經(jīng)的應力松弛實驗數(shù)據(jù)，得出了各組大鼠視神經(jīng)的歸一化應力松弛函數(shù)方程，建立大鼠視神經(jīng)的歸一化應力松弛函數(shù)方程，能定量的闡明大鼠視神經(jīng)的應力松弛力學特性。本文的創(chuàng)新性是以視神經(jīng)的應力松弛特性等研判視神經(jīng)損傷模型以BNTF、以hUCBSC干預視神經(jīng)損傷的效果。

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吉林省科技發(fā)展計劃資助項目(20110492)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0901-04

2016-12-24)