吳曉冬，薄立華，王小昆，朱 輝

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學研究中心，吉林 長春130033；2.吉林大學第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130021)

大鼠MK-shRNA腺病毒表達載體的構(gòu)建

吳曉冬1，薄立華1，王小昆1，朱 輝2*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學研究中心，吉林 長春130033；2.吉林大學第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130021)

Midkine(MK)基因是在1988年日本學者Kadomatsu[1]等發(fā)現(xiàn)的一種cDNA 克隆。其表達產(chǎn)物在胚胎發(fā)育早期至中期時在多種組織中表達，但隨著胚胎的發(fā)育而逐漸減少，在成體鼠只有腎臟和子宮兩個臟器有表達。因為能與肝素結(jié)合并相互作用，又被稱為肝素結(jié)合生長因子。MK在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育生長中有諸多功能[2]，本課題組也已經(jīng)證明在腦缺血的急性期其表達增高[3]，近年也相繼報道MK在多種腫瘤組織中有高表達[4]。

RNA干擾(RNA interference RNAi)[5]技術(shù)可高效、特異地阻斷靶基因的表達。另外腺病毒載體導(dǎo)入效率高，靶細胞種類多，突變的可能性低，安全性相對較好。目前還未見有關(guān)在大鼠腦缺血中RNA干擾MK表達的研究，本實驗針對大鼠MK基因mRNA序列選取兩條靶序列，合成MK-shRNA，并且構(gòu)建了腺病毒載體pAd-MK-shRNA，為進一步建立下調(diào)MK基因表達的動物模型及其MK功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

MK基因寡核苷酸序列由genepharma公司合成;腺病毒載體ADV1購于genepharma;T4 DNA連接酶、EcoRI 和BamHI內(nèi)切酶、瓊脂糖回收試劑盒等分生試劑均購自Promega公司。

1.2 方法1.2.1 針對靶序列，設(shè)計合成寡核苷酸對 從Genebank大鼠MK基因mRNA序列中挑選出兩條符合要求的靶序列(位置分別在242和312處)，MK1-Rat-242:GCAAATACAAGTTTGAGAGCT、MK2-Rat-312:GAAGAAGGCTCGGTACAATGC、同時設(shè)定對照ADV1-NC：TTCTCCGAACGTGTCACGT。分別對每條靶序列設(shè)計出莖環(huán)結(jié)構(gòu)樣的正義鏈與反義鏈:MK-shRNA-242的正義鏈:5′-AATTCGCAAATACAAGTTTGAGAGCTTTCAAGAGAAGCTCT-AAACTTGTATTTGCTTTTTTG-3′;反義鏈-5′-GATCCAAAAAAGCAAATACAAGTTTGAGA-GCTTCTCTTGAAAGCTCTCAAACTTGTATT-TGCG-3′；MK-shRNA-312正義鏈：5′- AATTCGAAGAAGGCTCGGTACAATGCTTCAAGAG-AGCATTGTACCGAGCCTTCTTCTTTTTTG-3′和反義鏈 5′- GATCCAAAAAAGAAGAAGGCTCGGTACAATGCTCTCTTGAAGCATTGT-ACCGAGCCTTCTTCG-3′。其中在正義鏈的5’端添加EcoRI 酶切位點AATTC；在反義鏈的 5’端添加內(nèi)切酶 BamHI 酶切位點GATCC。最終MK-shRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)為正義鏈: 5′-AATTC-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(N18C)-TTTTTTG- 3′；反義鏈: 3′-G(CN18)-(AAGTTCTCT)-(N18G)-AAAAAACCTAG-5′。

分別將合成的兩對MK-shRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的正義鏈和反義鏈用 TE(pH8.0)溶解，濃度為 100 μM。形成雙鏈反應(yīng)體系：10×緩沖液 5 μl；MK-shRNA正義鏈(100 μM) 5 μl；MK-shRNA反義鏈(100 μM) 5 μl；ddH2O 35 μl 共50 μl反應(yīng)體系。設(shè)定溫度95℃ 5 min; 85℃ 5 min; 75℃ 5 min; 70℃ 5 min;最后4℃。將所得到的MK-shRNA-242和MK-shRNA-312的雙鏈模板溶液稀釋至終濃度為200 nM，用于與線性載體連接。

1.2.2 載體的酶切、純化回收 取 10 μg ADV1 載體，用EcoRI 和BamHI進行37℃ 酶切過夜，1%瓊脂糖電泳，回收純化線性載體ADV1，稀釋濃度至 50 ng/μl。

1.2.3 pAd-MK-shRNA 載體的構(gòu)建 雙鏈MK-shRNA-242和 MK-shRNA-312分別與ADV1載體連接，構(gòu)建載體pAd-MK-shRNA242和pAd-MK-shRNA312：10×T4連接緩沖液 2 μl；酶切回收的線性載體ADV1(50 ng/μl) 1 μl；雙鏈MK-shRNA 模板( 100 nM) 1 μl；T4 DNA連接酶( 5 U/μl) 1 μl；ddH2O 15 μl，共20 ul體系。22℃ 1 h，分別轉(zhuǎn)化制備的Top10感受態(tài)細胞。37℃培養(yǎng)16 h。

1.2.4 大鼠pAd-MK-shRNA表達載體篩選和鑒定 從每塊平板上挑取5個菌落，接種到含 50 μg/ml Ampicillin 的LB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng) 16 h。用質(zhì)粒抽提試劑盒取一部分質(zhì)粒進行測序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 載體ADV1酶切 用內(nèi)切酶EcoRI 和BamHI對載體ADV1進行酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳，得到線性化的載體片段，見圖1。

2.2 DNA測序

對構(gòu)建的兩個大鼠MK-shRNA表達載體pAd-MK-shRNA242和 pAd-MK-shRNA312，分別進行測序，序列與所設(shè)計的序列完全一致，證實MK正確插入ADV1載體中，見圖2。

圖1 EcoRI 和BamHI 雙酶切ADV1載體

pAd-MK-shRNA242：

pAd-MK-shRNA312

圖2 載體pAd-MK-shRNA的DNA測序結(jié)果

3 討論

Midkine(MK)和Pleiotrophin(PTN)是一類肝素結(jié)合生長因子家族僅有的兩個成員。它們在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中具有重要作用。MK是分泌型蛋白，富含堿性氨基酸殘基，含有10個半胱氨酸，組成5對二硫鍵。MK在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育生長中有諸多功能，如：促進神經(jīng)細胞生長存活、促進神經(jīng)軸突生長的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能顯著提高中腦的多巴胺性的神經(jīng)元生存能力等。MK還是與多種細胞分化、增殖、修復(fù)及血管生成有關(guān)的生長因子[2]。另外MK現(xiàn)已研究證實其在許多腫瘤中也都有表達的改變[4]，諸如結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌等等。

RNA干擾(RNA interference，RNAi )[5]是一種新興的高效特異的基因阻斷技術(shù)，其機制是雙鏈RNA介導(dǎo)的同源信使RNA(mRNA)序列高效特異性降解的現(xiàn)象，從而特異地抑制靶基因的表達，同時不影響其他基因功能。Elbashir等[6]證實導(dǎo)入長度為21-25nt 的雙鏈小分子RNA恰好能在哺乳動物細胞內(nèi)特異地抑制靶基因表達，故而利用短發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)，成為人工誘導(dǎo)RNAi基因沉默的一種常用方法。shRNA是由單個轉(zhuǎn)錄單位產(chǎn)生，通常不激活動物細胞的干擾素應(yīng)答毒性，shRNA結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，使用更有優(yōu)勢。人工合成shRNA治療一直被認為是一種很有前途的方法，所以該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于探索基因功能和惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。

腺病毒載體除了有轉(zhuǎn)染效率高、副作用少等優(yōu)點外，其缺點主要是在體內(nèi)可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)剛好是一個免疫獲免區(qū)，且腺病毒表達持續(xù)時間較短，屬于瞬間表達，故其在腦缺血急性期的基因治療中將會更有發(fā)展?jié)摿?。而且，分析缺血半暗帶腦血流后發(fā)現(xiàn)，基因轉(zhuǎn)染后腦血流閾值可達到靜息狀態(tài)下的40%，提示對缺血半暗帶進行基因轉(zhuǎn)染治療腦梗塞可行。將腺病毒載體注射到側(cè)腦室，側(cè)腦室壁細胞可以長期表達轉(zhuǎn)染基因。如在側(cè)腦室進行白介素1受體拮抗劑基因轉(zhuǎn)染，可減小腦梗塞面積[7]。因此，可以通過抗炎細胞因子或生長因子的基因轉(zhuǎn)染來治療腦缺血。Ronit[8]在大鼠右側(cè)大腦中動脈阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAo)造成局灶性缺血90 min后，皮質(zhì)注射攜帶對神經(jīng)元有保護作用的膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的腺病毒載體，證明了可以減少大腦皮質(zhì)的梗死體積。

我們對Midkine已經(jīng)進行了多年的研究，構(gòu)建了Midkine的原核表達載體[9]，在大腸桿菌中進行表達，得到了純化的Midkine蛋白質(zhì)，并且進行了Midkine在局灶性腦缺血中的表達研究，結(jié)果在正常大鼠腦組織中沒有Midkine的表達，只是在胎鼠腦組織中有強表達，在局灶性腦缺血后1天即有Midkine的表達，14天無Midkine表達[3]，我們的研究結(jié)果表明Midkine是一種即時表達因子，參與腦缺血急性期的修復(fù)。由此考慮Midkine是一種可用于腦缺血治療的因子。本次我們設(shè)計了兩條干擾序列，合成構(gòu)建了兩條大鼠MK-shRNA腺病毒表達載體：pAd-MK-shRNA242和pAd-MK-shRNA312，通過測序證明構(gòu)建成功，腺病毒載體中加載了GFP和Amp基因，更有利于篩選驗證，為后續(xù)應(yīng)用到大鼠MCAO模型動物實驗，為深入研究MK基因的功能和作用機制打下了良好的基礎(chǔ)。

[1]Kadomatsu K,Tomomura M， Muramatsu T，et al.cDNA Cloning and sequencing of a new gene intensely expressed in early differentiation stages of embryonal carcinoma cells and in mid-gestation period of mouse embryogenesis[J].Biochem Biophys Res Commun,1988，151:1312.

[2]Yoshida Y,Sakakima H,Matsuda F,et al.Midkine in repair of the injured nervous system[J].Br J Pharmacol，2014，171(4):924.

[3]朱 輝，劉 群，張淑琴,等.Midkine在局灶性腦缺血中的表達及意義[J].中風與神經(jīng)疾病雜志，2002，4：223.

[4]Jones DR.Measuring midkine: the utility of midkine as a biomarker in cancer and other diseases[J].Br J Pharmacol，2014，171(12):2925.

[5]Tuschl T.Expanding small RNA interference[J].Nature Biotechnol,2002,20 (5):446.

[6]Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21 nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J].Nature,2001,411(6836):494.

[7]Ishikawa E,Ooboshi H,Kumai Y,et al.Midkine gene transfer protects against focal brain ischemia and augments neurogenesis[J].J Neurol Sci，2009， 285(1-2):78.

[8]Ronit H,Liola L,Hongein Li,et al.Need for caspases in apoptosis of trophic factor-deprived PC12 cells[J].J Neuronsci Res，1997,50:69.

[9]吳曉冬，薛立娟，楊紹娟，等.肝素結(jié)合生長因子Midkine基因在大腸桿菌中的克隆、表達和純化[J].中國免疫學雜志，2006，22(4)：346.

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20120704)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0904-03

2016-10-17)