趙志欣， 李臘梅， 蔣恩社

(河南大學(xué)公共衛(wèi)生研究所， 開(kāi)封 475004)

神經(jīng)鞘磷脂合成酶2缺乏對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

趙志欣， 李臘梅， 蔣恩社△

(河南大學(xué)公共衛(wèi)生研究所， 開(kāi)封 475004)

目的：探討神經(jīng)鞘磷脂合成酶2缺乏對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，方法：實(shí)驗(yàn)采用雄性的野生型小鼠(WT)和神經(jīng)鞘磷脂酶合成酶2缺乏小鼠(KO)，每組10只，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7 d的定位航行試驗(yàn)檢測(cè)，之后進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，以檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果：定位航行試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組小鼠找到平臺(tái)的潛伏期、游泳距離均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；空間探索試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組小鼠的目標(biāo)象限滯留時(shí)間占總時(shí)間的百分比和小鼠穿越平臺(tái)區(qū)的次數(shù)也無(wú)顯著性差異(P>0.05)；但野生型小鼠的搜索策略優(yōu)于神經(jīng)鞘磷脂合成酶2缺乏小鼠(P<0.05)。結(jié)論：神經(jīng)鞘磷脂合成酶2缺乏影響小鼠的搜索策略，但不影響小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

神經(jīng)酰胺；神經(jīng)鞘磷脂合成酶2；學(xué)習(xí)記憶；搜索策略

ceramide; sphingomyelin synthase 2; learning and memory; search strategy

【DOI】 10.12047/j.cjap.5470.2017.039

鞘脂類化合物在人體內(nèi)廣泛存在并且是各種生物膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分，特別是其中的神經(jīng)酰胺(ceramide)和神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin, SM)在維持細(xì)胞膜功能的完整性方面具有重要的作用。神經(jīng)酰胺作為細(xì)胞膜的組成成分，參與了細(xì)胞凋亡(包括自噬)和應(yīng)激等生理功能[1]。神經(jīng)酰胺主要的代謝途徑是在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)神經(jīng)鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthases, SMSs)的作用轉(zhuǎn)化成SM。在哺乳動(dòng)物中，SMS有兩種同工酶即神經(jīng)鞘磷脂合成酶1(sphingomyelin synthase 1, SMS1)和神經(jīng)鞘磷脂合成酶2(sphingomyelin synthase 2, SMS2)。SMS1主要存在于細(xì)胞高爾基體，而SMS2則主要存在于細(xì)胞膜上[2]。細(xì)胞膜上除了富含SMS2外，還富含神經(jīng)鞘磷脂酶(sphingomyelinases，SMases)它可以將SM水解為神經(jīng)酰胺。細(xì)胞膜上的神經(jīng)酰胺和SM都可以通過(guò)外

泌作用進(jìn)入血漿中，因此SMS2和神經(jīng)鞘磷脂酶在維持細(xì)胞和血漿中神經(jīng)酰胺和SM水平的平衡中起著重要作用[3]。有研究表明，SMS2的缺失或失活可使神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化合成SM的途徑受阻，進(jìn)而血漿中SM的水平降低，神經(jīng)酰胺水平升高[4,5]。血漿中神經(jīng)酰胺水平升高還與2型糖尿病肥胖患者胰島素抵抗嚴(yán)重程度之間有著很強(qiáng)的相關(guān)性[6]。另有研究表明，鞘脂類化合物還參與應(yīng)激及死亡配體誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡[7]。另外在許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理變化中也觀察到有細(xì)胞內(nèi)SMSs和SMases兩種酶活動(dòng)的失調(diào)[8]。在阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)患者額顳區(qū)灰質(zhì)中發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)酰胺水平的升高和SM濃度的下降[9]。AD病人最典型的癥狀就是學(xué)習(xí)記憶能力的下降。Morris水迷宮(Morris water maze, MWM)實(shí)驗(yàn)是一種強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳，學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺(tái)的一種實(shí)驗(yàn)，可用于測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力之一的空間學(xué)習(xí)記憶能力。在MWM實(shí)驗(yàn)中，搜索策略是動(dòng)物尋找平臺(tái)所采用的游泳方式，在訓(xùn)練早期動(dòng)物可能采用非空間策略發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，而在隨后的訓(xùn)練中動(dòng)物會(huì)逐漸采用空間策略，因?yàn)椴捎眠@種搜索策略尋找平臺(tái)最為有效。這種搜索策略的改變是需要?jiǎng)游锖ｑR和前額皮質(zhì)參與的高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)。因此我們猜測(cè)SMS2缺乏導(dǎo)致神經(jīng)酰胺在學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)腦區(qū)內(nèi)的堆積，可能會(huì)進(jìn)一步對(duì)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力造成一定的影響。本研究利用SMS2基因敲除模型，采用MWM測(cè)試方法,分析神經(jīng)酰胺和SM對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶以及高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的影響，為人們認(rèn)識(shí)神經(jīng)酰胺及SM的生理作用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是由美國(guó)紐約州立大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心引進(jìn)的SMS2基因敲除雜合子小鼠(SMS+/-)經(jīng)過(guò)雜交、回交和互交等方法進(jìn)行繁殖獲得。通過(guò)提取小鼠的DNA，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠的基因型，獲得SMS2+/+和SMS2-/-基因型小鼠。小鼠分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水和食物。飼養(yǎng)室溫度控制在20～25℃，采光控制為12 h光照，12 h黑暗。測(cè)試前依據(jù)基因型(SMS2+/+, SMS2-/-)分別分組為野生型小鼠(Wild type, WT)和SMS2基因敲除小鼠(Knockout, KO)。每組小鼠各10只，均為黑色成年雄性小鼠。

1.2 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)使用成都泰盟科技有限公司制造的MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，圓形反應(yīng)水箱直徑為80 cm，逃逸平臺(tái)直徑為5 cm，箱內(nèi)盛水，水溫為室溫?cái)z氏25℃左右，平臺(tái)置于水面下1 cm。在水中加入白色顏料以避免動(dòng)物看清水下平臺(tái)。攝像機(jī)位于水池中央上方200 cm，用于記錄動(dòng)物的位置、時(shí)間、游泳距離和以及游泳路徑等。

實(shí)驗(yàn)分為定位航行試驗(yàn)(place navigation)和空間探索試驗(yàn)(spatial probe)兩個(gè)階段。定位航行試驗(yàn)歷時(shí)7 d，首先將小鼠置于水迷宮測(cè)試所在房間30 min以適應(yīng)環(huán)境。將水池分為4個(gè)象限，平臺(tái)置于第三象限，每天將小鼠面向池壁分別從4個(gè)象限之一輕輕放入水中。每天每只小鼠訓(xùn)練2次, 時(shí)間間隔大于30 min。實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)定小鼠游泳時(shí)間為60 s，若小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，人為地引導(dǎo)小鼠找到平臺(tái)，潛伏期記為60 s。小鼠登上平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上停留10 s。記錄每天每組小鼠潛伏期、游泳距離、游泳速度和游泳軌跡。依據(jù)記錄的小鼠游泳軌跡可將小鼠對(duì)平臺(tái)的搜索分為空間搜索策略和非空間搜索策略。如圖1所示，空間搜索策略是指小鼠采用直接游向目標(biāo)象限或者最多用一圈路程便游向平臺(tái)的模式。非空間搜索策略包括系統(tǒng)搜索策略和重復(fù)環(huán)繞策略。系統(tǒng)搜索策略是指小鼠系統(tǒng)地搜索水池而對(duì)目標(biāo)象限沒(méi)有清晰的空間定位，屬于一種“地毯式”搜索；而重復(fù)環(huán)繞策略是指小鼠不停地以環(huán)狀軌跡沿著水池邊游泳的模式來(lái)搜索平臺(tái)。由于空間搜索策略對(duì)目標(biāo)象限有較清晰的定位，該策略優(yōu)于非空間搜索策略。

空間探索試驗(yàn)(spatial probe)于第8天進(jìn)行，將平臺(tái)撤除，將動(dòng)物由原先平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中，游泳60 s。記錄和小鼠穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)、游泳距離、平均游泳速度及目標(biāo)象限滯留時(shí)間占總時(shí)間的百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每只小鼠每天兩次測(cè)量結(jié)果的算術(shù)平均值作為小鼠當(dāng)天的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，每組10只小鼠每天的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。定位航行試驗(yàn)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，空間探索試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果

2.1 定位航行試驗(yàn)

兩組小鼠7 d定位航行試驗(yàn)訓(xùn)練結(jié)果分析見(jiàn)表1。WT小鼠和KO小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期和游泳距離隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均明顯縮短，雙因素重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析顯示，時(shí)間因素(day) 主效應(yīng)明顯(P<0.001)，表明兩組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高。分組因素的檢驗(yàn)結(jié)果顯示分組因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明兩組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有差異。對(duì)兩組小鼠的平均游泳速度進(jìn)行方差分析表明兩組小鼠之間每天的平均游泳速度并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明兩組小鼠在體力上不存在顯著性差異。

2.2 兩組小鼠對(duì)平臺(tái)搜索策略的比較

對(duì)小鼠游泳軌跡進(jìn)行平臺(tái)搜索策略分類，兩組小鼠每天定位航行試驗(yàn)訓(xùn)練中搜索策略占總策略的百分比分布圖分別見(jiàn)圖2A和圖2B。對(duì)定位航行試驗(yàn)訓(xùn)練中7 d內(nèi)兩種小鼠三種搜索策略平均百分比進(jìn)行分析(圖3)，結(jié)果表明WT小鼠采用空間策略百分比明顯高于KO小鼠(P<0.05)，而KO小鼠采用重復(fù)環(huán)繞策略百分比明顯高于WT小鼠(P<0.05)。在搜索策略的選擇上，WT小鼠的搜索策略以更有效的空間搜索策略為主，優(yōu)于KO小鼠。

Tab. 1 The performance of the WT and KO mice during the place navigation trials over 7-day training (mean±SEM)

WT: Wild type; KO: Knockout

Fig. 1 Three typical swim-tracking paths used by the mice during the place navigation training phase A: Spatial search; B: Systematic search; C: Repetitive loop

Fig. 2 Distribution of search strategies used by mice over 7-day trials A: Search strategies used by wild type mice; B: Search strategies used by knockout mice

2.3 空間探索試驗(yàn)

3 討論

神經(jīng)酰胺和SM是構(gòu)成各種生物膜結(jié)構(gòu)的兩種重要的鞘脂類化合物，他們通過(guò)SMS2和神經(jīng)鞘磷脂酶在細(xì)胞膜內(nèi)進(jìn)行神經(jīng)酰胺/SM循環(huán)，進(jìn)而調(diào)節(jié)兩種鞘脂類化合物在細(xì)胞膜和血漿中的平衡狀態(tài)。本研究觀察SMS2酶缺乏對(duì)成年小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高級(jí)活動(dòng)-學(xué)習(xí)記憶能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SMS2酶缺乏對(duì)小鼠在水迷宮中的空間學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有影響，但卻影響小鼠的平臺(tái)搜索策略，SMS2缺乏小鼠采用空間搜索策略的比例下降。

神經(jīng)酰胺和SM作為兩種重要的鞘脂參與應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等多種生理和病理過(guò)程[1]。在肝豆?fàn)詈俗冃约膊≈?，高濃度的Cu2+可以激活酸性神經(jīng)鞘磷脂酶和升高血漿中神經(jīng)酰胺水平，導(dǎo)致肝細(xì)胞和紅細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。而肝細(xì)胞和紅細(xì)胞的功能正常對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)和氧氣來(lái)源具有重要作用，肝豆?fàn)詈俗冃约膊≈械纳窠?jīng)和精神癥狀表現(xiàn)也可能和血漿中升高的神經(jīng)酰胺水平有關(guān)。對(duì)一組健康婦女9年的跟蹤研究表明，志愿者血清中神經(jīng)酰胺水平升高與AD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間存在著強(qiáng)烈的相關(guān)性[11]。我們猜想SMS2缺乏可能會(huì)對(duì)高級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生影響。然而本研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SMS2缺乏對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有顯著的影響。推測(cè)其原因可能有以下幾個(gè)方面：首先，對(duì)于鼠類來(lái)說(shuō)，空間記憶是依賴于海馬的陳述性記憶，內(nèi)側(cè)顳葉包括海馬、嗅皮層和旁海馬皮層在這一過(guò)程中起著重要作用。SMS2缺乏雖然會(huì)影響血漿中神經(jīng)酰胺和SM的平衡，但是并沒(méi)有顯著改變細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺和SM水平[3]。因而有可能這些腦區(qū)的的功能沒(méi)有受到較大的影響。SMS2缺乏小鼠潛伏期隨著時(shí)間的延長(zhǎng)明顯下降表明小鼠可以對(duì)平臺(tái)位置形成良好的記憶。由于兩組小鼠在游泳速度上并無(wú)差異，因此兩組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力并沒(méi)有受到體力改變等外界因素的影響。其次，有研究表明SMS2酶缺乏對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化也有有利的一面，SMS2酶缺乏可以降低小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[12-14]，也可以增加胰島素的敏感性和減緩高脂飲食誘發(fā)的肥胖[15]，因此SMS2缺乏導(dǎo)致的血漿中神經(jīng)酰胺和SM平衡的改變是否會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生顯著的影響還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究。最后需要指出的是，本研究采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，但是水迷宮實(shí)驗(yàn)也易受到多種因素的影響。有研究表明，老年小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，慢性應(yīng)激對(duì)老年小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響較青年小鼠更為顯著[16]。本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)成年雄性小鼠進(jìn)行研究，那么隨著年齡的增加SMS2缺乏是否會(huì)對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有顯著性影響還有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)SMS2缺乏對(duì)小鼠的更高級(jí)的神經(jīng)活動(dòng)有一定的影響，在搜索策略方面，野生小鼠主要以空間搜索策略搜尋平臺(tái)，而SMS2缺乏小鼠主要采用空間搜索和重復(fù)環(huán)繞策略來(lái)搜尋平臺(tái)，從搜索策略優(yōu)越上來(lái)看，SMS2缺乏小鼠搜索策略不如野生型小鼠。搜索策略的改變反應(yīng)小鼠行為認(rèn)知能力的變化，表明SMS2缺乏誘發(fā)的血漿中神經(jīng)酰胺和SM平衡的改變對(duì)大腦的更高級(jí)的神經(jīng)活動(dòng)產(chǎn)生了影響。已知AD是一種與年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知能力受損的疾病，有研究表明在AD發(fā)病的早期額葉皮層內(nèi)與脂筏相結(jié)合的SM水平顯著降低[17]。這些腦區(qū)的輕度受損都有可能影響到動(dòng)物的行為認(rèn)知能力。具體SMS2缺乏會(huì)影響到哪一個(gè)或者哪些腦區(qū)? 都還有待于進(jìn)一步的研究。

總之，SMS2缺乏雖不能影響小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但卻影響到小鼠對(duì)搜索策略的選擇，SMS2缺乏對(duì)動(dòng)物各個(gè)系統(tǒng)的影響是復(fù)雜的。在臨床實(shí)踐中，理解循環(huán)系統(tǒng)或者細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺和SM水平改變對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用、作用部位及其潛在的影響，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)血液中兩種物質(zhì)水平的異常，以及預(yù)防和治療與記憶認(rèn)知有關(guān)的老年性疾病具有重要意義。

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2016-06-30

2016-12-15

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