張志超，王 敏，曹青云，李 琦，肖順麗，關(guān)亮俊，高榮凱，張宏桂

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

·實驗研究·

正交試驗優(yōu)選參葛抗衰復(fù)方的提取工藝研究

張志超，王 敏，曹青云，李 琦，肖順麗，關(guān)亮俊，高榮凱，張宏桂

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的 采用正交試驗法優(yōu)選參葛抗衰復(fù)方的最佳提取工藝。方法 以葛根素轉(zhuǎn)移率和干膏得率為葛根水提評價指標(biāo)，以加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)為影響因素，以人參總皂苷含量、干膏得率為人參醇提評價指標(biāo)，以乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)為影響因素，優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果 水提最佳條件為加15倍量水煎煮3次，每次1.5 h；醇提最佳條件為9倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h。結(jié)論該方法合理可行，穩(wěn)定可靠，葛根素和人參總皂苷轉(zhuǎn)移率高。

人參；葛根；正交試驗；提取工藝

參葛抗衰復(fù)方由人參、葛根等中藥組方，具有補益元氣、健脾益肺、安神生津的功效。人參中的人參皂苷在抗衰老方面效果很好[1－3]，用 70%乙醇提取率[4－6]。葛根主要成分葛根素抗氧化效果顯著[7－9]，葛根水提物比醇提物抗氧化能力強[10]。人參、葛根合并給藥比合提給藥在消化道內(nèi)的吸收更快[11]，故將人參和葛根單獨提取。本研究中確定人參采取乙醇提取和葛根采取加水煎煮提取的工藝路線，通過正交試驗，以葛根素轉(zhuǎn)移率和干膏得率為水提評價指標(biāo)，加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)為影響因素；以人參總皂苷含量、干膏得率為醇提評價指標(biāo)，加醇量、提取時間、提取次數(shù)為影響因素進(jìn)行優(yōu)選，并分別進(jìn)行了3次驗證試驗，結(jié)果工藝合理可行、穩(wěn)定可靠，可為中試及大生產(chǎn)工藝的最終確定提供實驗室依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 1525型高效液相色譜儀（2489UV／Visible檢測器，Breeze 2色譜工作站）；TU－1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)； CPA225D／100型及BSA 124S型電子天平（0.01 mg及0.1mg，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；DZ－2BC型真空干燥箱（天津市麥斯特儀器有限公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

葛根素對照品（批號為110752－201514），人參皂苷Re對照品（批號為110754－201626），均購自中國食品藥品檢定研究院；葛根藥材購自安國藥材市場，人參藥材購自撫順昊源生物科技有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為豆科植物野葛 Pueraria lobate (willd.)ohwi的干燥根和五加科植物人參 Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根莖。甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 水提工藝優(yōu)選

2.1.1 因素水平設(shè)計

將葛根加水煎煮的工藝路線，通過 L9(34)正交表進(jìn)行試驗設(shè)計，以葛根素轉(zhuǎn)移率和干膏得率為水提評價指

表1 葛根水提工藝因素水平表

2.1.2 試驗方法

稱取葛根藥材9份，每份30 g，按 L9（34）正交表條件加水提取，過濾，合并濾液，減壓濃縮至100m L，備用。

2.1.3 水提干膏得率測定

精密量取濃縮液25mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，減壓干燥至恒重，取出，置干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算干膏得率。

2.1.4 葛根素含量測定

色譜條件：色譜柱為ThermoC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇－水（25∶75）；檢測波長：250 nm；流速：1 m L／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按葛根素峰計應(yīng)不低于4 000。

供試品溶液制備：取葛根提取物干膏，研細(xì)，稱取0.1 g，精密稱定，加50mL 30%乙醇溶解，稱定質(zhì)量，超聲30 min，冷卻至室溫后再稱定質(zhì)量，30%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：稱取葛根素對照品2.86 mg，精密稱定，置25m L容量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻，即得。精密吸取對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，分別置1.0mL容量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，分別吸取10μL注入液相色譜儀，于250 nm波長下檢測，記錄葛根素峰面積。以各成分峰面積為縱坐標(biāo)（Y，A）、對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，C，g／L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葛根素線性回歸方程 Y＝45 093 306X－23 640，r＝0.999 9(n＝6）。結(jié)果表明，葛根素質(zhì)量濃度在0.011 44～0.114 4 g／L范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

樣品含量測定：精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定葛根素峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中葛根素的質(zhì)量濃度，測得樣品含量。

2.1.5 正交試驗及方差分析

按 L9(34)正交試驗條件進(jìn)行煎煮提取，共得到9份水提取液，依法測定葛根素轉(zhuǎn)移率和干膏得率。結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表2可見，以葛根素轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，則最佳提取工藝為A2B3C3，C因素有顯著性差異(P＜0.05)；以干膏得率為指標(biāo)，則最佳提取工藝為A3B3C3，C因素有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 醇提工藝優(yōu)選

2.2.1 因素水平設(shè)計

將人參加醇回流的工藝路線，通過 L9(34)正交試驗表進(jìn)行設(shè)計，以人參總皂苷含量和干膏得率為醇提評價指標(biāo)，以加乙醇量(A)、回流時間(B)、回流次數(shù)(C)為影響因素進(jìn)行優(yōu)化，因素水平表見表4。

2.2.2 試驗方法

稱取人參藥材9份，每份30 g，按 L9（34）正交表的條件加70%乙醇提取，過濾，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，備用。

表2 葛根水提工藝優(yōu)選正交試驗結(jié)果

表3 葛根水提工藝優(yōu)選方差分析表

表4 人參醇提工藝優(yōu)選因素水平表

2.2.3 醇提干膏得率測定

精密量取濃縮液25mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，減壓、干燥至恒重，取出，置干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算干膏得率。

2.2.4 人參總皂苷含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：取人參皂苷Re對照品5.34mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含1.068mg的溶液，即得對照品溶液。精密吸取對照品溶液20，40，80，120，160，200μL，分別置具塞試管中，低溫?fù)]去溶劑，加入1%香草醛高氯酸試液0.5 mL，置60℃恒溫水浴，充分混勻后加熱15min，立即用冰水冷卻2 min，加入77%硫酸溶液5 mL，搖勻；以試劑作空白。消除氣泡后照紫外－可見分光光度法，于540 nm波長處測定吸光度，以人參皂苷Re對照品溶液質(zhì)量濃度（C，μg／mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)（Y，A）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程 A＝0.022 4C＋0.003 4，r＝0.999 1(n＝6）。結(jié)果表明，人參皂苷Re質(zhì)量濃度在3.88～38.84μg／m L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

供試品溶液制備：取人參醇提取物干膏，研細(xì)，稱取0.1 g樣品，精密稱定，置50m L容量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取100μL，即得。

樣品含量測定：按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中人參皂苷Re的量，計算結(jié)果乘以0.84，即得人參總皂苷含量。

表5 人參醇提工藝優(yōu)選正交試驗結(jié)果

表6 人參醇提工藝優(yōu)選方差分析表

2.2.5 正交試驗及方差分析

按 L9(34)正交試驗設(shè)計表進(jìn)行醇提，共得到9份提取液，依法測定人參總皂苷含量及干膏得率。結(jié)果見表5，方差分析見表6。以人參總皂苷含量為指標(biāo)的最佳提取工藝為A2B3C3，C因素有顯著差異(P＜0.05)；以干膏得率為指標(biāo)的最佳提取工藝為A2B3C3，C因素有顯著差異(P＜0.05)。綜合考慮，人參醇提工藝為A2B2C3，即加入9倍量70%乙醇，提取3次，每次1.5 h。

2.3 驗證試驗

按處方比例平行稱取3份飲片，根據(jù)最佳工藝條件進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果見表7。對葛根素、人參總皂苷含量進(jìn)行測定，平行性較好，表明該工藝合理可行、穩(wěn)定可靠。

表7 正交試驗驗證結(jié)果（%）

3 討論

本試驗中在對各味藥有效成分綜合分析的基礎(chǔ)上采用水提和醇提相結(jié)合的方法，并選取與功能相關(guān)的葛根素和人參總皂苷作為評價指標(biāo)，同時把干膏得率也作為重要指標(biāo)，綜合評價提取工藝中主要影響因素的各項參數(shù)，由于A2葛根素轉(zhuǎn)移率最高，干膏得率較A3少，可以減少用藥量，考慮工業(yè)化生產(chǎn)，減少能源消耗及成本等問題，在不影響提取率的條件下選加水量為15倍即A2。綜合考慮，葛根水提取工藝為A2B3C3，即加入15倍量的水，提取3次，每次提取1.5 h。由表5可見，提取1.5 h與提取2 h對總皂苷含量的影響差異不大，而出膏率較小，可以減少服藥量，考慮工業(yè)化生產(chǎn)，節(jié)約時間，減少能源消耗及成本等問題，因此選擇提取1.5 h，即B2。最終確定了參葛抗衰復(fù)方的最佳提取工藝，為中試及生產(chǎn)提供了依據(jù)。

本試驗中還對藥材浸泡時間與吸水率進(jìn)行了考察，否則溶劑尚未滲透進(jìn)飲片，有效成分無法溶解出來。從吸水率曲線中發(fā)現(xiàn)，葛根在浸泡60min后的吸水量幾乎無變化，說明此時吸水已達(dá)到飽和，吸水率為130%，因此確定浸泡時間為60 min。進(jìn)行正交試驗時，第1次須多加葛根質(zhì)量1.3倍的水，第2，3次加正常倍量水，在中試或大生產(chǎn)中，第1次提取時也需多加1.3倍量的水，提取效果更理想。

[1]韓知忖，劉 冰，周 輝.人參皂苷Rg1對神經(jīng)細(xì)胞衰老和衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，26(4):322－323.

[2]彭 沛，宋志明，劉 勇，等.人參皂苷Rb1抗小鼠腦自然衰老及其對mTOR／p70S6K通路的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2015，36(2):176－180.

[3]鄭 敏，將裕蕓，周 暢，等.人參皂苷對衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶和腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].宜春學(xué)院學(xué)報，2013，35(6): 68－71.

[4]韓 宵，朱 磊，閆春風(fēng)，等.多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法優(yōu)選人參醇提工藝[J].中國現(xiàn)代中藥，2016，18(1):110－113.

[5]楊宗林，李 慧，王 冰，等.Q－TOF LC／MS技術(shù)分析乙醇體積分?jǐn)?shù)對人參單體皂苷提取率的影響[J].中國藥房，2015，26(34):4834－4836.

[6]劉繼菊.人參總皂苷提取工藝條件優(yōu)化研究[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2010，8(14):200－201.

[7]吳景東，王 培，李東子 .葛根及葛根素對自然衰老小鼠m tDNA片段缺失的實驗研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(11): 2119－2120.

[8]彭少君.葛根素抗衰老作用實驗研究[J].山東醫(yī)藥，2009，49(20):45－46.

[9]徐曉虹.葛根素抗 D－半乳糖致衰老小鼠的脂質(zhì)過氧化作用[J].中國中藥雜志，2003，28(1):66－69.

[10]戴紅旗，鄢貴龍，劉沐東，等.葛根提取物抗氧化活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(24):10508－10509.

[11]陳益杭，李孟璇，孟兆青，等.藥對研究(Ⅲ)——葛根人參藥對對大鼠腸吸收的影響[J].中國中藥雜志，2015，40(15):3094－3099.

Extraction Process of Panax Ginseng and Pueraria Lobata Anti－Aging Com pound Prescripation

Zhang Zhichao,Wang M in,Cao Qingyun,Li Qi,Xiao Shunli,Guan Liangjun,Gao Rongkai,Zhang Honggui
(College of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing,China 100102)

Objective To optimize the extraction process of Panax Ginseng and Pueraria Lobata anti－aging compound prescripation by orthogonal design method.M ethods The optimum extraction process was optimized by orthogonal test,the transfer rate and dry extract yield and of puerarin were taken as the index of evaluation of water extracting process,with the amount of water,decocting time,decocting times were influence factors,the ginseng total saponin content and dry paste yield were taken as the evaluation index,the amount of alcohol,refluxing time,refluxing times were taken as influence factors.Resu lts The optimal conditions of water extraction is adding 15 times water boiling for 3 times,each time 1.5 h;the optimal conditions of alcohol extraction is adding 9 times 70% alcohol refluxing for 3 times,each time 1.5 h.Conclusion The method is feasible,stable and reliable,and has high rate of puerarin and total saponin content.

Panax Ginseng;Pueraria Lobata;orthogonal test;extraction process

TQ 460.6

A

1006－4931(2017)07－0005－04

國家自然科學(xué)基金資助項目[3 0 8 7 0 2 6 2]。

張志超（1992－），男，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，（電子信箱）zhangzc5＠163.com。

張宏桂（1 9 5 5－），男，教授，研究方向為中藥藥效物質(zhì)應(yīng)用、體內(nèi)代謝，（電話）0 1 0－8 4 7 3 8 6 4 2（電子信箱）b z y 7 1 4＠1 6 3.c om。標(biāo)，以加水量(A)、煎煮時間(B)、煎煮次數(shù)(C)為影響因素進(jìn)行優(yōu)化。因素水平表見表1。

2017－01－08)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.07.002