葉 彬 來麗群

浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

實驗研究

俞氏灌腸方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腫瘤壞死因子及白細胞介素的影響*

葉 彬 來麗群

浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

目的：觀察俞氏灌腸方對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的治療作用以及對腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-10（IL-10）的影響。方法：48只SD大鼠隨機分成俞氏灌腸方原劑量組、低劑量組、美沙拉嗪組、模型組各10只，空白對照組8只。予以三硝基苯磺酸建立模型后，分組灌腸給藥2周后處死。觀察其結(jié)腸組織學(xué)改變情況，并測定其血清TNF-α、IL-2、IL-10的含量。結(jié)果：①俞氏灌腸方原劑量組、低劑量組、美沙拉嗪組治療后疾病活動指數(shù)（DAI）評分與模型組相比明顯下降(P＜0.01)，且原劑量組評分下降較其他2組更為明顯(P＜0.01)。②3個治療組大鼠的組織學(xué)評分較模型組明顯降低(P＜0.01)。③3個治療組與模型組相比，血清TNF-α均有明顯的降低(P＜0.01)，IL-2、IL-10有明顯的升高(P＜0.01)；原劑量組血清IL-2升高更為明顯(P＜0.01)。結(jié)論：俞氏灌腸方能有效緩解潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的腸道炎癥，治療作用與藥物的濃度相關(guān)，其主要的優(yōu)勢在于能有效的提高IL-2水平。

俞氏灌腸方 潰瘍性結(jié)腸炎 腫瘤壞死因子 白細胞介素 實驗研究

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是以侵犯大腸黏膜與黏膜下層為主的炎癥性腸病，較容易出現(xiàn)遷延不愈或反復(fù)發(fā)作等情況。有研究表明，在過去20年內(nèi)，我國UC的發(fā)病率增高了6倍[1]。故研究其發(fā)病機理，改善治療方法，提高治療效果十分必要。本研究觀察全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導(dǎo)老師俞尚德的經(jīng)驗方俞氏灌腸方對三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的大鼠UC模型的治療作用及對腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-10（IL-10）的影響，以期系統(tǒng)、規(guī)范評價和確證俞氏灌腸方的療效，部分揭示其治療UC的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物：選擇健康的SD大鼠48只，6周齡，體重120±20g，雌雄各半。由浙江省動物實驗中心提供。隨機分為5組，其中俞氏灌腸方原劑量組（以下簡稱原劑量組）、俞氏灌腸方低劑量組（以下簡稱低劑量組）、美沙拉嗪組、模型組，每組10只，正常對照組8只。

1.2 實驗藥物及試劑:5%三硝基苯磺酸（TNBS）購自浙江達文生物醫(yī)藥有限公司；俞氏灌腸方藥物組成:蒲公英、黃芩、敗醬草、紅藤、丹參各30g，半邊蓮、半枝蓮、生薏仁各20g，由杭州市中醫(yī)院藥劑科提供，并由制劑中心制備濃縮成1.05g/ml的滅菌原液。美沙拉嗪顆粒劑購自博福益普生（天津）制藥有限公司，將1000mg顆粒劑磨成粉后，用滅菌蒸餾水溶解后稀釋配制成5mg/ml的混懸液待用。大鼠IL-2，IL-10，TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自R&D公司；水合氯醛、無水乙醇等購自杭州市中醫(yī)院藥劑科。

1.3 主要實驗儀器:37℃恒溫箱，微量移液器，京君龍實驗儀器北京有限公司；全自動酶標(biāo)儀（Bio-Tek ELX800）Bio-Tek，美國；低溫離心機（3-18KS）Sigma，德國，切片機（RM2015），萊卡，德國；萊卡病理成像系統(tǒng)，LEICA，德國；BM-H型病理組織包埋機，安徽電子科學(xué)研究所；顯微鏡（BX51T-PHD-J11)，奧林巴斯，日本。

2 實驗方法

2.1 UC大鼠模型的建立：動物分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫20±2℃，濕度40%～60%，光暗周期各12h環(huán)境飼養(yǎng)。造模采用較為常用的三硝基苯磺酸（TNBS）與乙醇聯(lián)合誘導(dǎo)建立UC大鼠模型的方法[2]。3天后大鼠內(nèi)出現(xiàn)腹瀉、黏液膿血便后，證實造模成功。

2.2 分組給藥方法:空白組正常喂養(yǎng)，模型組每天予以生理鹽水0.4ml灌腸，原劑量組予以實驗藥物0.4ml灌腸，每日劑量為3.5g/kg；低劑量組以每日1.75g/kg的劑量灌腸；美沙拉嗪組則予以美沙拉嗪混懸液0.4ml灌腸，每日劑量為16.7mg/kg。

2.3 疾病活動指數(shù)(DAI)觀察：每天大便性狀、飲食、活動等情況，并應(yīng)用聯(lián)苯胺直接棉棒法晨測便潛血1次。對所有小鼠進行體重下降、大便性狀、血便3方面的評分，評分標(biāo)準(zhǔn)為疾病活動指數(shù)(DAI)[3]。

2.4 動物標(biāo)本的取材:于給藥第2周末先腹腔注射水合氯醛麻醉后，剪開腹腔，于腹腔靜脈處抽取靜脈血2ml，分離出血清，-80℃保存。留取距肛2cm左右的結(jié)腸標(biāo)本，觀察形態(tài)，存于4%甲醛固定，送病理檢測，對所有切片的病理組織學(xué)改變評分[4]。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 DAI評分:見表1。

表1 各組大鼠給藥后DAI評分結(jié)果(±s，分)

表1 各組大鼠給藥后DAI評分結(jié)果(±s，分)

注:與模型組比較，*P＜0.01；與原劑量組比較，#P＜0.01。

藥后2周末0* 1.37±0.29 0.87±0.31*0.68±0.17*0.94±0.19*組別空白組模型組美沙拉嗪組原劑量組低劑量組只數(shù)8 10 10 10 10第3天0.37±0.16*2.20±0.76 1.97±0.56 2.09±0.49 2.13±0.32藥后1周末0.13±0.08*2.17±0.77 1.23±0.33*#0.96±0.37*#1.52±0.42*#

3.2 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察:光鏡下觀察模型組組織學(xué)評分明顯高于其他組（P＜0.01）；3個藥物治療組未見明顯的潰瘍及糜爛，低劑量組及美沙拉嗪組有少量的炎性細胞侵潤，3組間比較無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠組織學(xué)評分結(jié)果(±s，分)

表2 各組大鼠組織學(xué)評分結(jié)果(±s，分)

注:與模型組比較，*P＜0.01。

組別空白組模型組美沙拉嗪組原劑量組低劑量組只數(shù)8 10 10 10 10組織學(xué)評分0.46±0.23*11.27±2.25 4.32±2.43*3.79±0.95*4.48±1.63*

3.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-10水平:使用ELISA試劑盒測各組血清中TNF-α、IL-2、IL-10的含量。與模型組比較，各治療組的血清TNF-α均有明顯的下降，血清IL-2、IL-10有明顯上升（P＜0.01）；原劑量組血清IL-2升高較劑量組及美沙拉嗪組更為顯著（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-10水平(±s)

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-10水平(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.01；與原劑量組比較，#P＜0.01。

組別空白組模型組美沙拉嗪組原劑量組低劑量組IL-10（pg/ml）42.7875±2.3666*29.5050±1.6745 35.6230±1.4176*36.7340±1.6425*32.9010±1.5968*只數(shù)8 10 10 10 10 TNF-α（ng/L）123.0925±6.1408*194.8680±9.3208 162.0880±5.6380*167.2370±7.6618*177.4660±4.6110*IL-2（ng/L）291.1488±10.4470*182.5520± 9.9620 237.8190±12.1858*#257.4040±11.5020*225.7950± 9.6816*#

4 討論

關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制，近年來對免疫異常和炎性遞質(zhì)學(xué)說較為重視。目前根據(jù)細胞因子在炎癥反應(yīng)中所起的作用，將其分為兩類，即促炎性細胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等）和抗炎性細胞因子（IL-2、IL-4、IL-10和TGF-β等）。腸道炎癥的啟動與進展，與這兩組因子間的平衡失調(diào)有關(guān)[5]。

潰瘍性結(jié)腸炎屬于中醫(yī)學(xué)中“泄瀉”“痢疾”“便血”“腸風(fēng)”等范疇[6]。本病的病機為濕熱久稽，蘊結(jié)大腸，熱入營血，大腸血絡(luò)受損。俞氏灌腸方中蒲公英清熱解毒，為君藥；黃芩、敗醬草清瘀排膿為臣藥；半枝蓮、半邊蓮消腫解毒，生薏仁化濕健脾，紅藤、丹參活血通絡(luò)共為佐藥。諸藥合用共奏清熱解毒、消腫散瘀、祛濕化濁之功效。

本實驗結(jié)果顯示，俞氏灌腸方原劑量組UC大鼠的一般狀況、結(jié)腸表現(xiàn)及病理表現(xiàn)比模型組有明顯的改善，其癥狀改善的速度較低劑量組及美沙拉嗪組有明顯的優(yōu)勢；且原劑量組大鼠TNF-a水平明顯下降，IL-2、IL-10的水平有明顯升高，上調(diào)IL-2的作用較為顯著。上述結(jié)果說明，俞氏灌腸方能迅速的減輕UC的癥狀，減少腸道炎癥，促進潰瘍愈合，其作用程度與藥物的濃度相關(guān)，其作用機理與調(diào)節(jié)細胞因子間的平衡有關(guān)。與美沙拉嗪相比較，其主要的優(yōu)勢在于提高IL-2的水平。

[1]Chow DK，Leonq RW,Tsoi KK．Long-term follow-up of ulcerative colitis in the Chinese population[J]．Am J Gastroenter,2009,104(3):647-654．

[2]葛翠翠，王慧娜,杜麗欣，等.炎癥性腸病小鼠模型的建立及其影響因素探討［J］.生物技術(shù)通訊，2013，24（4）:514-518.

[3]Murano M，Maemura K，Hirata I，et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B(p65)antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis[J]. Clin Exp Immuno，2000，120(1):51-58.

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[5]樊慧麗，陳玉梅.潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制和治療進展[J].中國全科醫(yī)學(xué).2012,15(2):228-230.

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2016-09-22

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目基于細胞因子網(wǎng)絡(luò)探討俞氏灌腸方灌腸對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的影響，編號：2013ZA092