汪 霞劉兵兵張慶英姚 沖

1 浙江省長(zhǎng)興縣中醫(yī)院 浙江 長(zhǎng)興 313100 2 山東省聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院 山東 聊城 252000 3 浙江省湖州市中心醫(yī)院 浙江 湖州 313000

中藥研究

木賊藥材HPLC指紋圖譜及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究*

汪 霞1劉兵兵1張慶英2姚 沖3#

1 浙江省長(zhǎng)興縣中醫(yī)院 浙江 長(zhǎng)興 313100 2 山東省聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院 山東 聊城 252000 3 浙江省湖州市中心醫(yī)院 浙江 湖州 313000

木賊 指紋圖譜 高效液相色譜 質(zhì)量評(píng)價(jià)

木賊藥材為木賊科植物木賊的干燥地上部分。目前，藥典收載正品木賊有1種，常見(jiàn)混淆品種有問(wèn)荊、筆管草、節(jié)節(jié)草[1-2]。本文對(duì)市面上銷售的10批木賊藥材樣品進(jìn)行指紋圖譜研究，并建立了相應(yīng)木賊藥材HPLC指紋圖譜評(píng)價(jià)方法，為評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥:供含量測(cè)定用的對(duì)照品山柰素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110861-201310）、山柰酚-3，7-雙葡萄糖苷、山柰酚-3-雙葡萄糖-7-葡萄糖苷、山柰酚-3-雙葡萄糖苷（自制，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)MS，1H-NMR，13C-NMR和DEPT譜確證，面積歸一化法檢測(cè)純度大于98%）。甲醇、乙腈均為色譜純，美國(guó)Dima公司；冰醋酸、磷酸均為分析純；水為自制純凈水。木賊藥材經(jīng)長(zhǎng)興縣中醫(yī)院郭小元中藥師鑒定其原植物為木賊科木賊的干燥地上部分，藥材來(lái)源及產(chǎn)地見(jiàn)表1。

表1 木賊藥材樣品來(lái)源

1.2 儀器:惠普1100型高效液相色譜儀，配有四元梯度泵，在線脫氣機(jī)，柱溫箱，二級(jí)管陳列檢測(cè)器；CP225D型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件:色譜柱:YMC-Pack ODS-A（150mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相:甲醇（A）0.5%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5min，0%A；5～20min，0%→20%A；20～30min，20%A；30～55min，20%→70%A）；流速:0.8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng):295nm；柱溫:35℃；進(jìn)樣量:10μL。理論板數(shù)按山柰素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備:取山柰酚-3，7-雙葡萄糖苷、山柰酚-3-雙葡萄糖-7-葡萄糖苷、山柰酚-3-雙葡萄糖苷和山柰素對(duì)照品適量，精密稱定，用50%甲醇超聲溶解，配置成濃度分別為 27.95，45.22，32.12，56.95μg/mL的混合對(duì)照溶液。

2.3 供試品溶液的制備:取木賊樣品粗粉0.2g，煎煮2次，每次加水800ml，第1次2小時(shí)，第2次1小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至約50ml，放冷，加入乙醇使含醇量達(dá)70%，放置36小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇至無(wú)醇味，放冷，加入乙醇使含醇量達(dá)80%，放置36小時(shí)，濾過(guò)，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至8.0，放置36小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇至無(wú)醇味，冷藏36小時(shí)，加入活性炭，在110℃加熱40分鐘，放冷至室溫，濾過(guò)，濾液置50ml量瓶中，加流動(dòng)相溶液至刻度，搖勻，再用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察:分述如下。

2.4.1 精密度試驗(yàn):精密稱取木賊藥材(編號(hào)S2) 0.2g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積及保留時(shí)間，結(jié)果表明其相對(duì)峰面積的RSD為0.23%，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.16%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn):精密稱取木賊藥材(編號(hào)S2) 0.2g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、1、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為1.02%，各色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD為2.3%，表明處理后的供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取木賊藥材(編號(hào)S2)0.2g共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察方法的重復(fù)性。結(jié)果表明其相對(duì)峰面積的RSD為1.3%，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為2.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立:指紋圖譜及共有峰的標(biāo)定取自不同來(lái)源的10批次木賊藥材，按“2.3”方法制備供試品溶液，照“2.1”條件進(jìn)行測(cè)定分析。通過(guò)比較各批次藥材色譜圖，確定22個(gè)特征峰，將HPLC色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系2004A版》軟件，建立木賊藥材指紋圖譜。將化學(xué)信息較多的S1號(hào)樣品設(shè)為典型色譜圖，與混合對(duì)照品圖譜對(duì)照，指認(rèn)其中4個(gè)色譜峰，分別為山柰酚-3，7-雙葡萄糖苷（9號(hào)峰）、山柰酚-3-雙葡萄糖-7-葡萄糖苷（11號(hào)峰）、山柰酚-3-雙葡萄糖苷（13號(hào)峰）和山柰素（21號(hào)峰），在各批次樣品圖譜中山柰酚-3，7-雙葡萄糖苷的色譜峰分離良好，峰面積較大且為所有樣品共有，所以確定9號(hào)峰為參比峰。

2.6 相似度評(píng)價(jià):采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》對(duì)10批木賊樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，S1～S10木賊樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果分別為0.982、0.963、0.954、0.953、0.963、0.959、0.968、0.986、0.978、0.971，分析結(jié)果顯示10批木賊相似度均在0.950以上，表明各產(chǎn)地木賊具有較高的相似度。

2.7 化學(xué)模式識(shí)別:分述如下。

2.7.1 系統(tǒng)聚類分析:將各色譜峰相對(duì)于內(nèi)參比色譜峰的峰面積量化，運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用歐氏距離作為樣品的測(cè)度，見(jiàn)圖1。根據(jù)圖3可以看出10批木賊藥材可以分為三大類，S2、S4、S5、S6聚為一類，S1、S7聚為一類，其余聚為一類。參照樣品產(chǎn)地，S2、S4、S5、S6的產(chǎn)地集中在東北地區(qū)。

圖1 木賊樣品聚類分析結(jié)果

2.7.2 主成分分析:10批木賊藥材樣品經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)獲得各批樣品的色譜數(shù)據(jù)，HPLC圖譜各共有峰的峰面積相對(duì)藥材稱樣量之比，即單位質(zhì)量藥材峰面積進(jìn)行量化，得到10×22階的數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS軟件對(duì)矩陣進(jìn)行分析，以主成分PC1和PC2所組成的維投影圖見(jiàn)圖2。10批木賊樣品分組結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致。

圖2 主成分分析平面投影圖

3 討論

目前，2010版《中國(guó)藥典》對(duì)于木賊的含量測(cè)定是將木賊甲醇提取物進(jìn)行酸水解，以苷元山柰素作為對(duì)照品。文獻(xiàn)報(bào)道的木賊成分測(cè)定方法多以苷元山柰素為指標(biāo)性成分[3-4]，而以黃酮苷作為木賊的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究報(bào)道不多[5]。本實(shí)驗(yàn)采用以水溶性苷類成分為主的木賊藥材指紋圖譜方法，從活性成分和“活性物質(zhì)群”角度來(lái)評(píng)價(jià)木賊品質(zhì)優(yōu)劣。研究結(jié)果顯示梯度洗脫分析耗時(shí)短，并且22個(gè)特征成分獲得較好的分離度，且酸性緩沖體系可明顯改善具有弱酸性酚羥基的黃酮醇類成分的分離效果和峰形。另外，研究還發(fā)現(xiàn)在295nm處指紋圖譜色譜峰具有良好峰形，且基線平穩(wěn)，因此選用295nm作為木賊指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)表明10批木賊藥材的化學(xué)成分組成較一致，批次間各成分種類高度相似而含量的有一定差異。聚類分析結(jié)果表明于不同地方購(gòu)買(mǎi)的藥材其產(chǎn)地可能相近或相同，這也與主成分分析分組相一致，應(yīng)用系統(tǒng)聚類分析和主成分分析2種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)木賊色譜積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行了模式識(shí)別的探討，兩者判斷結(jié)果基本一致。

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[3]張憲，趙惠萍，張小茜，等.木賊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2005，12(5):48-50.

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2016-06-13

浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)臨床藥學(xué)科研專項(xiàng)基金項(xiàng)目基于RWS的丹參多酚酸鹽臨床使用情況及安全性評(píng)價(jià)，編號(hào)：2013LYSX015；浙江省藥學(xué)會(huì)醫(yī)院藥學(xué)科研專項(xiàng)基金項(xiàng)目基于RWS的丹參多酚酸鹽基層醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，編號(hào)：2013ZYY17

# 通訊作者：姚 沖，E-mail：hzszxyy@foxmail.com