賀 巍， 朱 琳， 范興愛， 楊生岳， 劉睿年， 陳 磊

解放軍第四醫(yī)院消化內(nèi)科，青海 西寧 810007

快速進(jìn)入高海拔地區(qū)小腸動(dòng)力紊亂大鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞及P物質(zhì)表達(dá)的變化

賀 巍， 朱 琳， 范興愛， 楊生岳， 劉睿年， 陳 磊

解放軍第四醫(yī)院消化內(nèi)科，青海 西寧 810007

目的探討快速進(jìn)入高海拔地區(qū)發(fā)生小腸動(dòng)力紊亂過程中Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cell of Cajal，ICC)的作用機(jī)制。方法50只SD大鼠以低海拔地區(qū)(海拔400 m)為對(duì)照組，并以進(jìn)入高海拔地區(qū)(海拔4 300 m)后的時(shí)間節(jié)點(diǎn)依次分為1 d、3 d、7 d和14 d組，每組10只。測(cè)定各組大鼠小腸電活動(dòng)數(shù)據(jù)，應(yīng)用電子顯微鏡觀察小腸ICC的微觀結(jié)構(gòu)變化，應(yīng)用雙重免疫熒光組織化學(xué)染色的方法觀察同區(qū)域ICC的功能與P物質(zhì)(substance P，SP)的表達(dá)變化。結(jié)果快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后，大鼠小腸電波幅及波頻受損明顯，于高海拔區(qū)3 d組下行到最低點(diǎn)(P<0.05)。其小腸ICC的微觀結(jié)構(gòu)也可觀察到類似改變。使用雙重免疫熒光組織化學(xué)染色可發(fā)現(xiàn)，ICC與SP的表達(dá)呈同步變化，同樣在高海拔區(qū)3 d組表達(dá)下降到最低點(diǎn)(P<0.05)。結(jié)論快速進(jìn)入高海拔地區(qū)所致小腸動(dòng)力紊亂的發(fā)生，可能與小腸ICC及SP的表達(dá)變化有密切關(guān)系。

高原?。桓吆０?；小腸動(dòng)力；Cajal間質(zhì)細(xì)胞；P物質(zhì)；大鼠

快速進(jìn)入高海拔地區(qū)的人易因缺氧引起胃腸動(dòng)力紊亂，其多以食欲減退、惡心、腹脹等消化道癥狀最為突出，通常經(jīng)7～10 d的高原適應(yīng)后可逐漸緩解或消失[1]，目前有關(guān)快速進(jìn)入高海拔地區(qū)胃腸動(dòng)力紊亂的發(fā)生機(jī)制尚不明確。已知研究表明Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cell of Cajal, ICC)不但是胃腸基本電節(jié)律(basic electric rhythm)的起始點(diǎn)[2]，同時(shí)又扮演著傳導(dǎo)者的作用[3]，是胃腸道壁內(nèi)神經(jīng)與平滑肌間的信息傳導(dǎo)中介，對(duì)P物質(zhì)(substance P, SP)、內(nèi)源性一氧化氮(NO)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)等多種胃腸道活性物質(zhì)有反應(yīng)[4]，在胃腸動(dòng)力調(diào)控中發(fā)揮重要作用。SP則在胃腸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中起重要的興奮性作用，在胃腸道內(nèi)廣泛分布。為此本實(shí)驗(yàn)將使用雙重免疫熒光組織化學(xué)標(biāo)記的方法觀察大鼠小腸ICC與SP的表達(dá)變化，及快速進(jìn)入高海拔地區(qū)大鼠小腸動(dòng)力紊亂過程中ICC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑RM6280B生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠生產(chǎn))，超低溫冰箱(-80 ℃)及超低溫切片機(jī)(美國(guó)NUAIR公司)，F(xiàn)V1000激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，TecnaiG2分析透射電鏡(美國(guó)FEI公司)，兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(LifeSpan BioSciences公司)，小鼠抗大鼠單克隆SP抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，驢抗兔FITC標(biāo)記單克隆抗體(Abcom公司)，驢抗小鼠alexa fluor單克隆抗體(Abcom公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SD雄性大鼠50只，SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，以低海拔地區(qū)(西安，海拔400 m)為對(duì)照組。另以大鼠起運(yùn)后3 d內(nèi)進(jìn)駐實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)模擬快速進(jìn)入高海拔地區(qū)狀態(tài)，并以進(jìn)入高海拔地區(qū)(瑪多，海拔4 300 m)后的時(shí)間節(jié)為依據(jù)，依達(dá)到實(shí)驗(yàn)地區(qū)后的時(shí)間順序依次分為1 d、3 d、7 d和14 d組，每組10只。

1.3 小腸電生理活動(dòng)檢測(cè)SD大鼠術(shù)前12 h禁食，術(shù)前6 h禁水，戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，通過大鼠腹部正中切開，選擇大鼠幽門后10 cm處小腸漿膜層埋置引導(dǎo)電極，測(cè)量小腸電活動(dòng)變化，參數(shù)設(shè)定為“生物電，200 μV，0.02 s，100 Hz”，記錄波形并分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集與固定電生理測(cè)定完成后處死大鼠，剪開胸腔，經(jīng)升主動(dòng)脈插管，快速灌入生理鹽水沖去血液，于大鼠幽門后10 cm小腸處截取0.2 cm×0.1 cm大小組織，放入3%戊二醛固定用于電鏡染色，后繼續(xù)經(jīng)升主動(dòng)脈先快后慢灌注冷的(4 ℃)4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH=7.4)500 ml，注畢立即截取大鼠幽門后10～15 cm段置于20%的蔗糖溶液中過夜沉淀。

1.5 電鏡觀察小腸ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)變化取3%戊二醛固定后組織用0.2 mol/L蔗糖磷酸緩沖液漂洗，再用2%的四氧化鋨后固定1 h，丙酮中梯度脫水，在1%醋酸雙氧鈾中停滯染色1 h，再通過環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂。1 mm切片用亞甲藍(lán)染色，在光鏡下觀察，確定黏膜層、環(huán)形肌層、縱行肌層，再次經(jīng)70 nm超薄切片后用酒精醋酸雙氧鈾、再用檸檬酸鹽后染色，保留縱行肌層、環(huán)形肌層、黏膜下層、部分黏膜層，用透射電鏡觀察、照相。

1.6 雙重免疫熒光化學(xué)法標(biāo)記ICC及SP并觀察、采集圖像取固定后小腸組織0.4 cm×0.2 cm組織用超低溫切片機(jī)切片10 μm，使用0.01 mol/L PBS反復(fù)漂洗3次后，置入含0.3 % Triton X-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min(室溫)，再經(jīng)0.01 mol/L PBS液漂洗后進(jìn)行免疫組織化學(xué)熒光染色(以c-kit抗體標(biāo)記ICC)：分別加入兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(1∶150)及小鼠抗大鼠單克隆SP抗體(1∶200)孵育24 h(室溫)，經(jīng)0.01 mol/L PBS液漂洗3次后，分別加入熒光二抗，驢抗兔FITC標(biāo)記單克隆抗體(1∶400)及驢抗小鼠alexa fluor 594單克隆抗體(1∶400)，避光孵育2 h(室溫)。經(jīng)0.01 mol/L PBS洗3次后，80%甘油封片，以上過程均需避光操作。每切片取10張，在FV1000激光共聚焦顯微鏡下采用20倍及40倍視野觀察，每一張切片取6～8個(gè)視野，并將數(shù)字化圖像儲(chǔ)存。

2 結(jié)果

2.1 快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后大鼠在各時(shí)間段下的小腸電生理變化快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后，大鼠小腸電的波頻及波幅均受損明顯，1 d組即可觀察到明顯變化(P<0.05)，至3 d組下降到最低點(diǎn)(P<0.05)，此后緩慢恢復(fù)。波頻恢復(fù)相對(duì)較快，7 d組即基本恢復(fù)正常，與低海拔組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而波幅恢復(fù)相對(duì)較慢(見表1、圖1)。

組別只數(shù)波幅(mv)波頻(Hz)低海拔對(duì)照組10589.31±14.4748.59±0.76高海拔1d組10188.21±22.12*45.88±1.48*高海拔3d組10131.78±29.79#40.33±0.97#高海拔7d組10191.31±43.8546.36±1.03高海拔14d組10226.46±85.4549.85±1.01

注：與低海拔組比較，*P<0.01；與1 d組及7 d組比較，#P<0.05。

圖1 快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后大鼠小腸電活動(dòng)時(shí)程變化圖

A：低海拔對(duì)照組；B：高海拔1 d組；C：高海拔3 d組；D：高海拔7 d組；E：高海拔14 d組

Fig 1 Effects of ascending to high altitude on small intestine electrical activity in the rats

A: low altitude; B: high altitude 1 d; C: high altitude 3 d; D: high altitude 7 d; E: high altitude 14 d

2.2 快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后各時(shí)間段下大鼠小腸ICC的微觀結(jié)構(gòu)變化低海拔對(duì)照組ICC在電鏡下觀察可見：細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，縫隙連接緊密，核周細(xì)胞質(zhì)充盈，細(xì)胞器數(shù)量較多，細(xì)胞內(nèi)部罕見空泡樣改變，無(wú)凋亡小體?？焖龠M(jìn)入高海拔地區(qū)后，細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)開始受外界環(huán)境影響、受損，尤其在高海拔地區(qū)3 d組表現(xiàn)最為明顯。ICC細(xì)胞縫隙連接變得明顯松散；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，線粒體可見空泡樣腫脹、變性，部分可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張；核周細(xì)胞質(zhì)空泡樣改變加重，甚至部分ICC基膜不完整形成空洞；可見核固縮形成，核內(nèi)可見異染色質(zhì)，凋亡小體顯著增多(見圖2)。

圖2 快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后對(duì)大鼠小腸ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響

A：低海拔對(duì)照組(20500×)；B：高海拔1 d組(6000×)；C：高海拔3 d組(20500×)；D：高海拔7 d組(20500×)；E：高海拔14 d組(6000×)

Fig 2 Effects of ascending to high altitude on ultrastructure of ICC in the rats’ small intestine

A: low altitude (20500×); B: high altitude 1 day (6000×); C: high altitude 3 days (20500×); D: high altitude 7 days (20500×); E: high altitude 14 days (6000×)

2.3 快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后各時(shí)間段下小腸c-kit及SP表達(dá)的變化進(jìn)入高海拔地區(qū)后，大鼠小腸c-kit表達(dá)明顯下降，1 d組即出現(xiàn)明顯變化(P<0.05)，并于3 d組下行到最低點(diǎn)(P<0.05)，而后緩慢恢復(fù)。SP免疫熒光染色結(jié)果表明，其表達(dá)與ICC呈網(wǎng)絡(luò)樣分部，彼此緊密相鄰，表達(dá)變化與ICC表達(dá)改變同步，均于1 d組即出現(xiàn)改變(P<0.05)，于3 d組表達(dá)減少到最低(P<0.05)，而后緩慢恢復(fù)(見表2、圖3)。

組別只數(shù)c-kitSPc-kit/SP低海拔對(duì)照組1046.82±5.2146.72±4.9250.68±4.25高海拔1d組1033.01±3.68*33.01±3.84*36.91±3.07*高海拔3d組1030.31±2.95#29.61±3.80#33.69±2.70#高海拔7d組1034.67±3.8934.52±3.8937.85±3.34高海拔14d組1036.33±3.8836.28±3.7539.18±3.67

注：與低海拔組比較，*P<0.05；與1 d組及7 d組比較，#P<0.05。

3 討論

快速進(jìn)入高海拔地區(qū)的人們，因外界氣壓迅速降低會(huì)引起全身低張性缺氧，從而導(dǎo)致高原胃腸應(yīng)激反應(yīng)。本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明，在進(jìn)入地區(qū)海拔高度越高，大鼠小腸動(dòng)力下行的速度越快，恢復(fù)越慢，比起胃動(dòng)力下行的趨勢(shì)更為明顯，并且ICC在其中廣泛參與，并發(fā)揮重要的作用[5]。而作為胃腸動(dòng)力基本功能單位(basical functional unit GI motility, BFUGM)重要的組成部分ICC[6]，在小腸內(nèi)，依據(jù)功能和部位的不同可劃分為肌間ICC(ICC-MY)、肌內(nèi)ICC(ICC-IM)、深層肌層ICC(ICC-DMP)三種[7]。ICC-MY是導(dǎo)致起搏的主要細(xì)胞，自動(dòng)產(chǎn)生節(jié)律性慢波[8]，而ICC-IM則能夠?qū)CC-MY產(chǎn)生的起搏信號(hào)向下傳遞給與其形成緊密連接平滑肌，并對(duì)神經(jīng)信號(hào)傳遞進(jìn)行調(diào)節(jié)[3-9]，ICC-DMP則能被膽堿能及NOS陽(yáng)性神經(jīng)雙重支配[10]，其與ENS及鄰近的SMC存在特殊連接，形成“ENS-ICC-DMP-SMC”的功能單位?？梢娔c神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)的調(diào)控，除了直接作用于平滑肌系統(tǒng)外，主要通過ICC發(fā)揮作用，其對(duì)乙酰膽堿、SP、NO、VIP等多種神經(jīng)的遞質(zhì)均有反應(yīng)[4]。SP則作為一種重要興奮性的神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于整個(gè)胃腸道及ENS[11]，并對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)控廣泛發(fā)揮作用，是研究胃腸動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域的重要一種神經(jīng)遞質(zhì)[12]。通過本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后，伴隨大鼠小腸電活動(dòng)的明顯受損，ICC的微觀結(jié)構(gòu)及功能表達(dá)均出現(xiàn)明顯損傷，并同樣于高海拔地區(qū)的3 d組下降到最低點(diǎn)。雙重免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SP表達(dá)的變化與ICC表達(dá)改變同步，均于1 d組即出現(xiàn)改變，于3 d組表達(dá)減少至最低，而后緩慢恢復(fù)。其表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)叢與ICC呈網(wǎng)絡(luò)樣分布，彼此緊密相鄰，并與小腸平滑肌毗鄰，提示大鼠小腸SP的表達(dá)量降低，與小腸壁內(nèi)神經(jīng)元興奮性、小腸電基礎(chǔ)及平滑肌的活動(dòng)下降存在明顯關(guān)聯(lián)，其可能是快速進(jìn)入高海拔地區(qū)大鼠小腸動(dòng)力紊亂過程中ICC作用機(jī)制的重要組成部分。

注：E：Bar=50 μm，40×；其余：Bar=200 μm，20×。

圖3 快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后對(duì)大鼠小腸c-kit及SP表達(dá)影響

A：低海拔對(duì)照組；B：高海拔1 d組；C：高海拔3 d組；D：高海拔7 d組；E：高海拔14 d組

Fig 3 Expressions of ICC and SP in rats’ small intestine by ascending to high altitude

A: low altitude; B: high altitude 1 d; C: high altitude 3 d; D: high altitude 7 d; E: high altitude 14 d

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(責(zé)任編輯：李 健)

Expressions of the interstitial cell of Cajal and substance P in small intestine in the rats by ascending to high altitude

HE Wei, ZHU Lin, FAN Xing’ai, YANG Shengyue, LIU Ruinian, CHEN Lei

Department of Gastroenterology, the Fourth Hospital of PLA, Xining 810007, China

Objective To explore the mechanism of interstitial cells of Cajal (ICC) in rats with small intestine motility disorder by high altitude exposed. Methods Fifty SD male rats were divided into five groups, control group was located in low altitude (Xi’an, 400 m), on the basis of the time points of entering high altitude (Ma’duo, 4 300 m), rats were divided into four groups of 1 day, 3 days, 7 days and 14 days. Each group contained 10 rats. Rats’ small intestine electrical activity was measured in different groups. Electron microscopy was applied to observe the physiological ultrastructure of ICC, and the immunofluorescence staining was applied to observe the physiological function of ICC and the expression of substance P in small intestine. Results The amplitude and frequency of small intestine electrical activity of rats were lowest in high altitude 3 days group (P<0.05). The gap junctions and organelles of ICC were reduced. The expressions of ICC and substance P were the lowest in high altitude 3 days group (P<0.05). ConclusionThe changes of the expressions of ICC and SP in small intestine are closely related to small intestine dynamic disorders in high altitude exposed rats.

Mountain sickness; High altitude; Small intestine motility; Interstitial cell of Cajal; Substance P; Rat

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.03.008

青海省(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013-z-760)

賀巍，碩士，主任醫(yī)師，E-mail:hewei.1971@163.com

R574.5

A 文章編號(hào)：1006-5709(2017)03-0275-04

2016-08-06