急性髓系白血病中樹突狀細胞疫苗的免疫治療

周 文，李莉娟，王文媛，許麗麗，張連生

(蘭州大學第二臨床醫(yī)學院 蘭州大學第二醫(yī)院 血液科，甘肅 蘭州 730030)

·綜述·

急性髓系白血病中樹突狀細胞疫苗的免疫治療

周 文，李莉娟，王文媛，許麗麗，張連生

(蘭州大學第二臨床醫(yī)學院 蘭州大學第二醫(yī)院 血液科，甘肅 蘭州 730030)

急性髓系白血病(AML)中表達白血病相關抗原(LAAs)的白血病細胞來源的樹突狀細胞(DC)及負載LAAs的正常單核細胞來源的DC，均能有效誘導腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)反應，有望在治愈AML中發(fā)揮重要作用。本文就AML中DC疫苗的培育、分子標記的測定、功能的檢測作一介紹?？偨YDC疫苗治療AML臨床研究的新進展。

白血病， 髓樣， 急性;樹突細胞;免疫療法;疫苗

急性髓系白血病(AML)是白血病干細胞癌基因轉化而來的造血干/祖細胞的惡性腫瘤。盡管大多數(shù)患者在標準化療方案的誘導下能夠達到完全緩解，但復發(fā)率仍很高。造血干細胞移植是目前最有效的治療手段，但也存在微小殘留引起移植后復發(fā)的問題。因此，急需尋找更有效的腫瘤治療方法，進而消除微小殘留病灶，減少白血病復發(fā)。以樹突狀細胞為代表的細胞免疫治療有望成為治療腫瘤新方法，與其他免疫治療方法相比，樹突狀細胞(DC)免疫治療的特點主要有主動性免疫、特異性好、持續(xù)時間長，能夠針對性地消滅腫瘤干細胞或殘存腫瘤細胞，發(fā)揮強大的抗腫瘤免疫效應[1]。在緩解后AML患者外周血單核細胞(MO)中分離得到正常DC(MO-DC)，其不表達白血病分子標志，承載白血病相關抗原后，可有效誘導腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞 (CTL) 對白血病細胞的殺傷作用。在AML中白血病細胞可以直接分化為DC(AML-DC)。這些白血病來源的DC可以表達白血病抗原(LAAs)，有效誘導CTL對自身腫瘤細胞殺傷作用。根據(jù)這一原理設計的AML-DC及MO-DC疫苗正在進行臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗。

1 AML患者中DC的來源及體外培養(yǎng)

1.1DC的來源 采用流式細胞術四色射門方法檢測AML患者中DC的表達，結果顯示，69%的初治AML患者發(fā)病時檢測不到髓樣樹突狀細胞(mDC)和漿樣樹突狀細胞(pDC)，剩余31%的AML患者DCs水平是正常的或者升高的，在緩解后mDC水平可以恢復，而pDC水平相對較低；研究表明mDC升高或正常的AML-M4/M5較AML-M2/M3患者較常見，而pDC無此區(qū)別[2]。已知單核細胞和DC有共同的前體細胞，而AML-M4/M5的發(fā)病機制是單核前體細胞惡性病變，突變的細胞可能是分化為巨噬和樹突狀細胞前體細胞的細胞，存在向DC分化的潛能，提示DC來源于白血病細胞。

研究表明Fms樣酪氨酸激酶(FLT3)內(nèi)部串聯(lián)重復序列(ITD)突變陽性的大多數(shù)AML患者的mDc和pDC水平明顯高于ITD突變陰性者，從ITD+患者分離所得mDC和pDC均為ITD突變陽性，在體外培養(yǎng)后獲得DC形態(tài)，說明其為AML-DC[3]。AML患者完全緩解后分離的外周血MO-DC，用FISH技術(FISH)或者聚合酶鏈反應分析表明DCs無白血病標志，說明其來源于正常前體細胞，對自體白血病細胞有細胞毒性[4]。

AML患者外周血上清液可降低MO-DC的分化成熟及細胞凋亡。說明AML發(fā)病時，MO-DC數(shù)量減少，AML-DC增多；研究表明，AML患者完全緩解后mDC水平可以恢復[2]。推測可能為正常前體細胞來源DC增加。Danilov等[5]研究表明血管緊張素轉換酶(即CD143)在MO-DC上高表達，而在AML-DC上的表達較低，是第一個能夠區(qū)分AML患者DC來源的分子標記。

1.2AML-DC的體外培養(yǎng)AML-DC未培養(yǎng)時對自體AML細胞無明顯的殺傷活性，經(jīng)細胞因子培養(yǎng)成熟后的AML-DC可誘導效應T細胞對自體AML-DC有效殺傷。體外培養(yǎng)時，不同的細胞因子組合誘導AML-DC成熟，其成熟狀態(tài)有一定的差異。AML-DC來源于AML白血病細胞，具有正常DC的典型形態(tài)、表型和功能。目前，AML白血病細胞培養(yǎng)不能全部獲得AML-DC。Santiago-Schwarz等[6]第一次使用腫瘤壞死因子(TNF)、粒細胞巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、干細胞因子(SCF)及白介素(IL)6體外培養(yǎng)1例AML患者白血病細胞24小時后，其可分化為AML-DC。目前AML患者白血病細胞分化為AML-DC的最佳體外培養(yǎng)方案為重組GM-CSF聯(lián)合重組IL-4，0.7×106的白血病細胞在0.7～1ml的血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天后可獲得約0.3×106的成熟AML-DC，回收率約28%～50%[7]。

1.3AML-DC的分子標記檢測AML-DC具有AML患者白血病細胞的腫瘤相關抗原，且可遞呈抗原。體外誘導成熟的AML-DC具有DC的形態(tài)，使用相差顯微鏡觀察，其胞體較誘導前明顯增大，呈不規(guī)則形或樹枝狀突起。透射電子顯微鏡下，可見不規(guī)則形細胞核，位于胞漿一側，胞漿豐富及充分發(fā)育的高爾基體，且表達Ⅱ型主要組織相容性復合體(MHC)，是典型的成熟DC型態(tài)[8]。由AML患者白血病細胞培養(yǎng)所得的未成熟AML-DC較白血病細胞中CD14低表達，CD1a和人類白細胞DR抗原(HLA-DR)高表達；而CD11c，CD40和CD86無明顯差異[8]。AML-DC成熟后較白血病細胞高表達CD83，CD86，CD40，CD11c，CCR7和HLA-DR，CD14表達下調(diào)，CD1a和Toll樣受體(TLR)表達無明顯區(qū)別[8-9]。

2 AML患者中DC的功能

2.1AML患者不成熟DC的功能 不成熟DC的主要功能為捕捉抗原。DC通過表面表達的c型凝集素樣受體、TLR和螺旋酶等模式識別受體識別壞死的腫瘤細胞，且化療可增強DC識別腫瘤抗原的能力。

不成熟DC主要在骨髓和淋巴結中捕捉AML抗原，AML腫瘤細胞及胞外細胞因子可影響DC捕捉抗原功能。死亡的腫瘤細胞可以被DC捕捉，腫瘤細胞有壞死、凋亡、衰老和自吞噬，其中凋亡細胞影響DC的吞噬和處理，通過表達3種信號，即“發(fā)現(xiàn)我”，“吃掉我”和“別吃我”[10]。對于壞死細胞，DC可識別壞死細胞暴露的胞內(nèi)成分而進行吞噬遞呈。目前不成熟DC對腫瘤自吞噬細胞和衰老細胞的抗原遞呈尚不清楚。

2.2AML成熟DC的功能

2.2.1 成熟DC遞呈抗原的性質AML白血病細胞來源的AML-DC表達LAA。正常細胞來源的DC無白血病抗原，故需要負載AML抗原，負載的抗原包括AML多肽、AML細胞溶解殘余物、AML細胞所有RNA、凋亡的白血病細胞。有研究報道白血病凋亡濾泡是MO-DC最佳負載抗原，可有效激活CD8+T細胞，增強對腫瘤細胞的殺傷作用[11]。Li等[12]應用實時定量聚合酶鏈反應檢測AML-DC的3種白血病抗原表達，即黑色素瘤特異性抗原(PRAME)， 透明質酸介導的運動受體(RHAMM)和wilm腫瘤蛋白1(WT1)，結果顯示，15例AML患者的AML-DC表達至少一種LAA，且其在AML-DC上較白血病細胞表達高。

應用實時定量聚合酶鏈反應檢測AML-DC較白血病細胞LAAs表達水平變化，結果顯示7/12患者AML-DC上PRAME表達上調(diào)，6/12患者AML-DC上RHAMM表達上調(diào)，2/12患者AML-DC上WT-1表達上調(diào)，1/12患者AML-DC上蛋白酶-3表達上調(diào)，所有樣本至少高表達一種LAA；采用流式細胞儀觀察，AML-DCs與AML白血病細胞相比，CD40和CD80表達明顯上調(diào)，RHAMM、PRAME蛋白陽性[13]。

2.2.2 成熟DC的功能Nourizadeh等[7]研究報道15例AML患者中11例患者白血病細胞可分化為DC，其中大多數(shù)為M4、M5型，且AML-DC的平均回收率為42%，與上述研究報道相符。未成熟AML-DC經(jīng)Toll樣受體4和Toll受體7/8聯(lián)合刺激后可更好的成熟，成熟的AML-DC經(jīng)趨化因子介導，向淋巴結遷移，進而更有效的刺激T細胞免疫反應[7]。在體外，Toll樣受體激動劑活化的AML-DC可促進共刺激分子表達，大量分泌IL-12，增強TH1型反應，且能強效誘導特異性CTL靶向殺傷腫瘤作用[8]。

3 AML成熟DC誘導的免疫反應的增強

選擇最恰當?shù)腄C疫苗佐劑能夠減少疫苗接種數(shù)量、確保其對病原的快速反應、減少所需抗原數(shù)量、增強自身抗體免疫反應及確保其對特異性抗原最有效和適當?shù)拿庖叻磻猍14]。

3.1AML-DC的免疫反應的增強Brady等[15]研究表明用細胞轉染方法敲除AML-DC的信號轉導與轉錄激活因子基因3(STAT3)，可以增強AML-DC的免疫原性，增加T細胞的增殖及分化，用三氧化二砷(ATO)抑制AML-DC中STAT3的活性，可上調(diào)共刺激分子的表達，促進AML-DC的成熟，其誘導T細胞活化作用增強，IL-12p40分泌增加，增強CD8+T細胞對白血病細胞的殺傷作用。研究報道，鋅指蛋白A20負性調(diào)節(jié)AML-DC的成熟及其免疫刺激效應，估下調(diào)AML-DC中的A20或使其變性，可增強AML-DC的分化成熟，并通過核轉錄因子κB(NF-κB)信號同路，誘導自體CTL對AML腫瘤細胞特異性殺傷效應[16]。

在體外，TNF-α，脂多糖及TLR激動劑聯(lián)合刺激AML-DC成熟，可很大程度上增強AML-DC的抗原遞呈作用，CTL釋放干擾素-γ增多，增強CTL對AML白血病細胞的清除作用[17]。體外應用佐劑能夠進一步強化AML-DC誘導的免疫反應。Houtenbos等[18]研究報道，在AML-DC與自體或異體T細胞共培養(yǎng)中，加入4-1BBL蛋白可上調(diào)共刺激分子的表達，促進CD8+T細胞的增殖及其對白血病的細胞毒作用，誘導干擾素-γ高表達的TH1型反應，顯著增加WT1特異性T細胞，增強T細胞介導的淋巴細胞群對白血病細胞的溶解作用，表明在AML-DC治療AML中，4-1BBL是一種增強AML-DC誘導T細胞免疫反應的有效佐劑。

Schmitt等[19]用定量聚合酶鏈反應檢測到AML-DC高表達TLR2/4，低表達TLR9，加入TLR2配體微生物肽聚糖及脂磷壁酸、TLR4的配體脂多糖和TLR9配體寡核苷酸后可增加TNF-a和IL-6的分泌，促進TH1型反應，加強AML-DC疫苗對腫瘤的殺傷效應，說明微生物配體是增強AML-DC疫苗作用的有效佐劑。已知帶有甘露糖敏感血凝菌毛的銅綠假單胞菌可促進AML-DC的成熟，抑制初始T細胞向調(diào)節(jié)性T細胞分化，增強AML-DC對調(diào)節(jié)性T細胞的抑制作用，從而增強機體的抗白血病作用，可作為AML-DC疫苗的免疫佐劑。

3.2MO-DC免疫反應的增強 通過使用有效免疫佐劑增強MO-DC的免疫反應效應，MO-DC可更有效發(fā)揮抗腫瘤作用，有效清除腫瘤細胞，改善自體免疫功能。研究報道在體外用RNA電穿孔法使MO-DC生成IL-15，IL-15上調(diào)NK細胞的膜分子活性，NK細胞分泌干擾素-γ、顆粒霉素B及穿孔素增加，NK細胞對腫瘤細胞的敏感性及殺傷能力增強[20]。因此，在臨床應用中使用免疫佐劑增強MO-DC免疫功能后，可減少使用疫苗的數(shù)量，從而可減少使用疫苗后的臨床不良反應。

4 AML臨床中應用的DC疫苗

DC疫苗已進行臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗。臨床上使用免疫佐劑可有效增強DC疫苗的抗腫瘤效應，明顯改善非M3型AML患者的預后(圖1)。造血前體細胞來源DC和MO-DC可皮下或靜脈給藥，因其趨化到淋巴組織的能力強，而AML-DC趨化到淋巴組織的能力弱，估需要直接注射到淋巴結。AML-DC凍存長達21個月后仍然有效[21]。研究報道AML-DC疫苗用于臨床實驗治療非M3型的AML患者，3例患者在5.5～13個月期間保持病情穩(wěn)定，2例患者病情迅速進展死亡，未觀察到不良反應[21]。研究表明，在臨床實驗中MO-DC疫苗與AML-DC疫苗相比，能更有效活化AML患者中的腫瘤特異性T細胞的免疫反應[4]。

圖1 DC疫苗的臨床應用

新一代的MO-DC疫苗是由Toll樣受體在3天內(nèi)誘導成熟的，并且載有白血病相關抗原WT1蛋白及PRAME，從而誘導AML特異性的T細胞的免疫反應，已用于緩解后復發(fā)AML患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床實驗[22]。研究表明在AML患者中有一種特異的DC亞型DC8a，可靶向先天免疫系統(tǒng)，改善免疫耐受，靶點為Toll樣受體、CD47及STAT3，提示在先天免疫水平上，可抑制腫瘤細胞的免疫逃避，從而有益于患者[23]。

5 結語

雖然DC的研究已經(jīng)很深入，尤其是在體外的研究，但是仍然存在很多問題及不足，尚需進一步研究。我們還需探討決定DC成為耐受型或免疫原性DC的具體機制；準確評估臨床實驗DC疫苗的安全性；探索臨床應用中安全有效的DC疫苗劑量，密切注意尚未觀察到的臨床不良反應。對這些問題的深入研究將很大程度提高DC在AML免疫治療中的臨床應用，降低患者的復發(fā)及病死率。

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張連生，Email:zls170@yahoo.com

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1004-583X(2017)06-0549-04

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.06.024

2017-02-14 編輯:王秋紅