硫利達嗪聯(lián)合氯雷他定抑制胃腸道腫瘤作用的研究

張金梅++康文全++靳廣毅++陳婷婷

[摘要]目的 初步探討神經(jīng)系統(tǒng)藥物對胃腸道腫瘤的作用。方法 選取硫利達嗪、氯雷他定、東莨菪堿、多巴胺、乙酰膽堿、舒樂安定6種經(jīng)典的神經(jīng)系統(tǒng)藥物，利用CCK-8法，從0.01、0.1、1、10、100 μmol/L不同濃度梯度分別檢測其對胃腸道腫瘤體外的活性。并以小鼠脾臟淋巴細胞為模型，研究神經(jīng)系統(tǒng)藥物在體外對免疫細胞的安全性。結(jié)果 6種經(jīng)典的神經(jīng)系統(tǒng)藥物中，100 μmol/L東莨菪堿、100 μmol/L氯雷他定和10 μmol/L硫利達嗪對人結(jié)腸癌和人胃癌細胞產(chǎn)生毒性（均P<0.05），并且以硫利達嗪和氯雷他定的組合最為有效。6種神經(jīng)系統(tǒng)藥物僅對腫瘤細胞起到殺傷的作用，而對正常小鼠的脾淋巴細胞無毒性。10 μmol/L硫利達嗪聯(lián)合25 μmol/L氯雷他定體外抑制鼠源結(jié)腸癌細胞和鼠源胃癌細胞。結(jié)論 硫利達嗪聯(lián)合氯雷他定在體外可以有效地提高抗胃腸道腫瘤作用，為進一步聯(lián)合治療提供新策略。

[關(guān)鍵詞]硫利達嗪；氯雷他定；神經(jīng)系統(tǒng)藥物；胃腸道腫瘤；聯(lián)合治療

[中圖分類號] R979.1 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（c）-0004-05

[Abstract]Objective To discuss the preliminary effect of nervous system drugs on gastrointestinal tumors.Methods Thioridazine，Loratadine，Scopolamine，Dopamine，Acetylcholine and Estazolamum （0.01，0.1，1，10，100 μmol/L），six classical nervous system drugs were selected to detect the activities of gastrointestinal tumor in vitro by using CCK-8 assay.The spleen cells of mice were also used as the model to study the safety of the nervous system drugs in vitro.Results Among six classical nervous system drugs，cell growth on human colon and gastric cancer clells were suppressed by 100 μmol/L scopolamine，100 μmol/L Loratadine and 10 μmol/L Thioridazine （P<0.05），especially the combination of Thioridazine and Loratadine.Six drugs only played roles in killing tumors cells，while the spleen lymphocytes of normal mice were non-toxic.The growth of mouse gastrointestinal carcinoma cells in vitro were inhibited by 10 μmol/L thioridazine and 25 μmol/L Loratadine.Conclusion Thioridazine combined with Loratadine is proved to enhance anti-gastrointestinal tumor effects in vitro，and provides a new strategy for forward combination treatment.

[Key words]Thioridazine；Loratadine；Nervous system drugs；Gastrointestinal tumor；Combination therapy

中國腫瘤登記中心發(fā)布的《2013年中國腫瘤登記年報》數(shù)據(jù)顯示，我國死亡率最高的7種癌癥中與消化系統(tǒng)有關(guān)的癌癥就占了5種：肝癌、胃癌、食道癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌。因此，認(rèn)識及研究消化系統(tǒng)癌癥的發(fā)病機制，提高腫瘤的診療技術(shù)刻不容緩。傳統(tǒng)的治療方法有手術(shù)、化療、放療，但是這些方法常常無法消除所有的腫瘤細胞，有效率低。因此，聯(lián)合藥物腫瘤療法可能為胃腸道腫瘤的治療提供一種新的視角[1]。

2015年1月20日，美國臨床腫瘤學(xué)會（ASCO）發(fā)布了《ASCO年度報告：2015臨床腫瘤學(xué)進展》，在“十年回顧”中提到腫瘤患者的生存和存活質(zhì)量在過去的十年內(nèi)明顯改善，其中就有1項發(fā)現(xiàn)是聯(lián)合治療策略有效地延長腦腫瘤和前列腺癌患者的生存期[2]。由于腫瘤高度的異質(zhì)性、多樣性不僅存在于不同的腫瘤和不同的患者之間，也存在于同一個腫瘤內(nèi)。所以，單一的治療方法已經(jīng)很難同時克服腫瘤的異質(zhì)性和各類免疫抑制機制。從神經(jīng)系統(tǒng)藥物本身的神經(jīng)保護效應(yīng)來看，一線化療藥物聯(lián)合神經(jīng)藥物治療胃腸道腫瘤，可以防止化療藥對患者神經(jīng)的毒性，促使藥效更趨向于安全的方向發(fā)展。目前國際上提出許多聯(lián)合治療方案，但是，神經(jīng)系統(tǒng)藥物聯(lián)合治療提高抗腫瘤的療法，作為治療胃腸道腫瘤的一種新的治療策略尚未見報道。因此，利用神經(jīng)系統(tǒng)藥物調(diào)控消化系統(tǒng)癌癥在治療惡性腫瘤方面具有理論創(chuàng)新意義。鑒于以上研究進展，本課題選取了神經(jīng)系統(tǒng)中幾個經(jīng)典的藥物，通過檢測其對胃腸道腫瘤體外的活性，從而為胃腸道腫瘤治療的發(fā)展提供新策略。

1對象與方法

1.1對象

實驗用Balb/c雌性小鼠，體重（16±20）g，4～6周齡，購自廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心。人結(jié)腸癌細胞（HCT116）、小鼠結(jié)腸癌細胞（CT26.WT）和人胃癌細胞（SGC7901）、小鼠胃癌細胞（MFC）均購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。其他主要實驗試劑見表1。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞（HCT116）、小鼠結(jié)腸癌細胞（CT26.WT）和人胃癌細胞（SGC7901）、小鼠胃癌細胞（MFC）均用含10%胎牛血清、青霉素（100 μg/ml）和鏈霉素（100 μg/ml）的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗所用的細胞處于對數(shù)生長期。

1.2.2 CCK-8分析 在96孔板中配制100 μl的細胞懸液，每孔約1×104個細胞，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h（37℃，5%CO2），向培養(yǎng)板加入不同濃度的多巴胺（Dopamine）、硫利達嗪（Thioridazine）、氯雷他定（Loratadine）、乙酰膽堿（Acetylcholine）、東莨菪堿（Scopolamine）、舒樂安定（Estazolamum）單藥，或者這6種神經(jīng)系統(tǒng)藥物2、3種藥物聯(lián)合，處理24 h之后，向每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.3檢測神經(jīng)系統(tǒng)藥物對人結(jié)腸癌（HCT116）和人胃癌（SGC7901）細胞增殖及細胞活率的影響 選取不同濃度（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）多巴胺、硫利達嗪、氯雷他定、乙酰膽堿、東莨菪堿、舒樂安定，利用CCK-8檢測試劑分別檢測對人結(jié)腸癌（HCT116）和人胃癌細胞（SGC7901）增殖及細胞活率的影響。

1.2.4檢測神經(jīng)系統(tǒng)藥物對小鼠免疫細胞活率的影響

1.2.5硫利達嗪、氯雷他定、舒樂安定、東莨菪堿4種藥物不同排列組合 硫利達嗪、氯雷他定、東莨菪堿、舒樂安定4種藥物進行一系列不同組合（表2），每種藥物10 μmol/L。利用CCK-8檢測試劑分別檢測不同組合的神經(jīng)系統(tǒng)藥物對人結(jié)腸癌和人胃癌細胞活率的影響。

1.2.6觀察兩種藥物聯(lián)合使用的協(xié)同作用 采用聯(lián)合作用指數(shù)（CI）判斷兩種藥物的協(xié)同性，CI=AB/（A×B），A、B代表兩種不同藥物的吸光度。CI<1為協(xié)同作用；CI=1為疊加效應(yīng)；CI>1為拮抗作用。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)系統(tǒng)藥物對體外胃腸道腫瘤細胞活率的影響

利用CCK-8分別檢測不同濃度（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）多巴胺、硫利達嗪、氯雷他定、乙酰膽堿、東莨菪堿、舒樂安定這6種神經(jīng)系統(tǒng)藥物對人結(jié)腸癌（HCT116）和人胃癌（SGC7901）細胞增殖及細胞活率的影響。實驗結(jié)果如圖1所示，多巴胺、乙酰膽堿和舒樂安定與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），東莨菪堿和氯雷他定從100 μmol/L開始顯著抑制腫瘤細胞的活率（P<0.01），硫利達嗪從10 μmol/L開始對腫瘤細胞產(chǎn)生毒性（P<0.01）（圖1）。

2.2神經(jīng)系統(tǒng)藥物對小鼠免疫細胞活率的影響

以小鼠脾臟淋巴細胞為模型，研究神經(jīng)系統(tǒng)藥物在體外對免疫細胞的安全性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種神經(jīng)系統(tǒng)藥物對小鼠脾淋巴細胞的活率基本無影響，并且100 μmol/L的多巴胺或東莨菪堿可以促進淋巴細胞的增殖（P<0.01）（圖2）。提示神經(jīng)系統(tǒng)藥物僅對腫瘤細胞起到殺傷的作用，而對正常小鼠的脾淋巴細胞無毒性。

2.3神經(jīng)系統(tǒng)藥物聯(lián)合作用對胃腸道腫瘤細胞活率的影響

選取對人結(jié)腸癌細胞活率和人胃癌細胞活率產(chǎn)生抑制作用的硫利達嗪、氯雷他定、東莨菪堿這3種藥物與無腫瘤細胞活率抑制作用的舒樂安定進行一系列不同組合，每種藥物10 μmol/L，作用于人結(jié)腸癌（HCT116）細胞和人胃癌（SGC7901）細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凡是有硫利達嗪參與的組合（Group 1、2、3、5、7、9）都會顯著抑制腫瘤細胞的活率（P<0.01），并且以Group 9的硫利達嗪和氯雷他定的組合最為有效（圖3）。

2.4硫利達嗪和氯雷他定聯(lián)合抗腫瘤作用

利用鼠源的結(jié)腸癌細胞（CT26.WT）和鼠源胃癌細胞（MFC），將硫利達嗪（THZ）和氯雷他定（LOR）的研究濃度進一步縮小范圍，分別為1、5、10、25、50、75 μmol/L。在給藥24 h之后，利用CCK-8檢測試劑檢測到，兩種藥物抑制腫瘤的活率呈濃度梯度的方式，并且硫利達嗪從10 μmol/L開始顯著抑制腫瘤生長（P<0.01）；氯雷他定從25 μmol/L開始抑制人結(jié)腸癌細胞（HCT116）生長（P<0.01），50 μmol/L開始顯著抑制人結(jié)腸癌細胞生長（P<0.01）；氯雷他定從50 μmol/L開始顯著抑制人胃癌細胞（MFC）生長（P<0.01）（圖4）。

為了進一步明確硫利達嗪和氯雷他定潛在的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)，將10 μmol/L硫利達嗪分別與25、50、75 μmol/L氯雷他定進行不同的組合（圖4），利用CI指數(shù)公式，可以得出，10 μmol/L硫利達嗪與25 μmol/L氯雷他定聯(lián)用的組合，CI<1（小鼠結(jié)腸癌細胞CT26.WT CI=0.78；小鼠胃癌細胞MFC CI=0.55），呈協(xié)同作用，為最適組合濃度。

3討論

多巴胺是兒茶酚胺類家族重要的神經(jīng)遞質(zhì)，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道內(nèi)合成[3]，通過靶向細胞表面特異的受體而行使它的主要功能。多巴胺受體廣泛分布于大腦、心臟、腎臟、血管、腎上腺皮質(zhì)以及交感神經(jīng)末端。它包含5個亞型，分為兩大類：一個是D1樣受體（D1R，D1和D5），一個是D2樣受體（D2R，D2、D3和D4），都隸屬于G蛋白偶聯(lián)受體的超級家族。多巴胺兩種類型的受體具有相似的序列，但是擁有不同的藥理學(xué)特性，D1樣受體激活后升高細胞內(nèi)cAMP水平，而D2樣受體家族激活后降低細胞內(nèi)cAMP水平[4]。越來越多的研究表明多巴胺可以通過抑制腫瘤內(nèi)皮細胞上的血管表皮生長因子（VEGF-R2）的磷酸化活性，從而遏制腫瘤組織血管的生長而用于調(diào)控腫瘤的發(fā)展[5]。并且多巴胺通過激活D2樣受體而抑制腫瘤細胞的生長[6-7]。D2R敲除的小鼠表現(xiàn)出血管生成增多、腫瘤生長以及VEGF-R2磷酸化[8]。在乳腺癌以及結(jié)腸癌細胞模型中，D2R激動劑增強抗癌藥物的有效性，但是多巴胺本身并沒有抑制乳腺癌及結(jié)腸癌的細胞增殖和轉(zhuǎn)移[9]。許多研究將多巴胺與廣譜的抗癌藥阿霉素聯(lián)合來治療乳腺癌，成功降低了腫瘤的體積，增加了生存期[9]。同樣在人的結(jié)腸癌中，多巴胺聯(lián)合5-氟尿嘧啶也觀察到類似的結(jié)果。研究表明，多巴胺通過DRD1受體來抑制CD4+和CD8+的T細胞的增殖和毒性[10]，DRD1拮抗劑SCH23390阻斷DRD1受體通路后，小鼠淋巴細胞IL-4表達降低、IFN-γ表達增高[11]，并且抑制了腫瘤的生長和微管的密度[12]。

硫利達嗪通過靶向大腦中的多巴胺受體，來治療精神類疾病。2012年Cell雜志上公布，硫利達嗪通過靶向DRD2受體，成功消滅了人體的癌癥干細胞以及白血病細胞，而不會對正常的細胞產(chǎn)生副作用[13]。

抗組胺劑或?qū)δ承┠[瘤的癌癥具有抗癌功效。氯雷他定主要治療緩解過敏性皮膚病或過敏性鼻炎等癥狀及體征。通過拮抗H1受體，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制和麻醉的作用，所以也用于輔助治療某些精神病。有研究表明氯雷他定的活性代謝物地氯雷他定可以通過抑制STAT3和c-Myc的活性而誘導(dǎo)皮膚T細胞淋巴瘤的凋亡[14]。同樣該拮抗劑也在腫瘤肥大細胞[15]、在結(jié)腸癌中通過激活Chk1增加細胞周期中的G2/M期抑制腫瘤生長[16]。

乙酰膽堿在維持意識的清醒、學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知等活動中起到重要作用。研究利用α7型煙堿型乙酰膽堿受體拮抗劑可以防止肺癌的發(fā)生發(fā)展[17]。但是關(guān)于乙酰膽堿受體拮抗劑東莨菪堿作用于胃腸道腫瘤的報道極為少見。

在本研究中，選取了多巴胺、硫利達嗪、氯雷他定、乙酰膽堿、東莨菪堿、舒樂安定這6種經(jīng)典的神經(jīng)系統(tǒng)藥物分別檢測體外對人結(jié)腸癌（HCT116）和人胃癌（SGC7901）細胞增殖及活率的影響，并且檢測對小鼠脾淋巴細胞活率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這6種神經(jīng)系統(tǒng)藥物均對正常鼠的脾淋巴細胞無毒性，充分說明其抗腫瘤作用的安全性，且在6種藥物中只有東莨菪堿、氯雷他定和硫利達嗪對胃腸腫瘤細胞在體外有抑制作用。接下來，將具有體外抗腫瘤作用的藥物硫利達嗪、氯雷他定、東莨菪堿加上舒樂安定4種藥物進行不同組合進一步研究聯(lián)合抗腫瘤作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫利達嗪和氯雷他定的聯(lián)合處理，在體外抑制胃腸道腫瘤細胞生長最為有效。

當(dāng)評估腫瘤生長的抑制水平時，只有相對高的濃度，10 μmol/L的硫利達嗪或者50 μmol/L的氯雷他定單獨使用時可以對小鼠結(jié)腸癌細胞（CT26.WT）和小鼠胃癌細胞（MFC）顯示出細胞毒性。然而，10 μmol/L的硫利達嗪與25 μmol/L的氯雷他定在鼠源的結(jié)腸癌細胞（CT26.WT）的CI值為0.78，鼠源胃癌細胞（MFC）的CI值為0.55，均小于1，顯示出了協(xié)同效應(yīng)?；谝陨辖Y(jié)果，發(fā)現(xiàn)硫利達嗪與氯雷他定組合的最適濃度，為下一步研究神經(jīng)系統(tǒng)藥物聯(lián)合化療藥物治療胃腸道腫瘤進而提高抗腫瘤的療效奠定基礎(chǔ)。

由于單藥治療癌癥的效率有限，因此越來越多的證據(jù)表明，聯(lián)合療法可以增加任何單一藥物的有效性。硫利達嗪，一個被廣泛用于治療精神疾病的藥物，已有報道顯示可以選擇性的靶向白血病腫瘤干細胞[13]，并且在卵巢癌移植瘤中，通過抑制VEGFR-2/PI3K/mTOR的信號通路，起到抑制血管生成的作用[18]。硫利達嗪聯(lián)合多柔吡星可以增強抗癌藥物多柔吡星在多藥耐藥腫瘤細胞內(nèi)的濃度，而達到更好的抗癌效果[19]。氯雷他定，一種全世界廣泛用于口服的抗組胺劑，也有報道顯示通過G2/M期細胞周期阻滯，起到抗腫瘤的效應(yīng)[20]。

此次研究首次揭示了硫利達嗪和氯雷他定聯(lián)合應(yīng)用在體外顯示出更有效的抗胃腸癌的效應(yīng)，為進一步研究神經(jīng)系統(tǒng)藥物對胃腸道腫瘤的調(diào)控機制及與化療藥物聯(lián)用提高抗腫瘤療效奠定了基礎(chǔ)，并且為胃腸道腫瘤的治療方法提供了一種潛在策略。

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（收稿日期：2017-03-13 本文編輯：任 念）