王凱強，彭 晴，喬 宇，丁 慧，徐小輕，張宇微，魏晨陽，石 波

（中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所/農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081）

大豆細胞懸浮培養(yǎng)及其大豆異黃酮和抗毒素誘導(dǎo)積累研究進展

王凱強，彭 晴，喬 宇，丁 慧，徐小輕，張宇微，魏晨陽，石 波

（中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所/農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081）

大豆細胞懸浮培養(yǎng)是將大豆細胞及細胞團培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中的方法，應(yīng)用于大豆多種研究領(lǐng)域。從不同的外植體包括子葉、子葉節(jié)、下胚軸、幼胚、莖培養(yǎng)大豆細胞的方法，外源誘導(dǎo)物及前體對細胞積累大豆異黃酮以及誘導(dǎo)物對細胞合成和積累大豆抗毒素誘導(dǎo)效果進行綜述。大豆異黃酮和抗毒素是大豆產(chǎn)生的兩類具有生物活性的次生代謝物。在此基礎(chǔ)上，指出誘導(dǎo)中存在的問題及今后的研究方向，旨在通過增加誘導(dǎo)子的選擇而促進大豆細胞合成更高水平抗毒素及異黃酮提供一些思路。

大豆；細胞懸浮培養(yǎng)；誘導(dǎo)子；誘導(dǎo)；大豆異黃酮；抗毒素

植物細胞懸浮培養(yǎng)始于20世紀30年代［1］，該方法為植物學研究提供大量細胞材料，有助于在有關(guān)植物生理學、細胞學、組織學、形態(tài)學、生態(tài)學等領(lǐng)域開展試驗。懸浮培養(yǎng)是植物細胞培養(yǎng)方法之一，特點是首先由固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)獲得的愈傷分散在液體培養(yǎng)基釋放細胞，細胞與營養(yǎng)物質(zhì)接觸充分，搖晃培養(yǎng)為細胞輸送氧氣，整體培養(yǎng)環(huán)境一致促進細胞狀態(tài)保持同步。相比大田環(huán)境下生長的植物，室內(nèi)容器培養(yǎng)的細胞合成生物活性物質(zhì)有著諸多優(yōu)勢，其合成過程處于可控環(huán)境，能夠降低不利生物活性物合成的生物干擾，如微生物、昆蟲，還可篩選出生物活性物高產(chǎn)細胞系，提高目標物產(chǎn)量，可能實現(xiàn)細胞生長控制的自動化、代謝調(diào)節(jié)［2］。

早期的植物細胞獲取來源于機械或酶分離處理的葉肉和根尖細胞的培養(yǎng)增殖。然而，直接分離于植物個體的細胞，分化程度不同步，生理一致性較差，難以培養(yǎng)獲得均一性良好的細胞系。因此，現(xiàn)在建立的細胞懸浮培養(yǎng)體系，取用植物的外植體誘導(dǎo)愈傷，繼代數(shù)次獲得生長同步的愈傷組織，分散到液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，得到大量細胞，其操作主要包括外植體的選取、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選、懸浮系的繼代培養(yǎng)以及細胞生長狀態(tài)調(diào)控等［3］。

大豆是豆科大豆屬一年生草本，是我國重要糧食作物之一，除含人體必需的微量元素外，還有多種特殊生物學功能的活性物質(zhì)，如低聚糖、皂甙、異黃酮、多肽、蛋白以及磷脂［4］。其中，大豆異黃酮及其衍生物質(zhì)抗毒素是本文綜述的生物活性物。

大豆異黃酮及其異戊烯化物質(zhì)抗毒素是屬于大豆的兩類生物活性的次生代謝物。有研究表明，它們具有益于人體健康的生物活性功能，表現(xiàn)為抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)葡萄糖及能量代謝等。傳統(tǒng)上，大豆異黃酮主要采用有機溶劑從種子中浸提［5］，大豆抗毒素則來自硝酸銀［6］、褐藻酸寡糖［7］等外源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)處理過的種子合成。不同外源物對細胞合成大豆異黃酮及抗毒素量的誘導(dǎo)效果不同。此外，大豆異黃酮和抗毒素合成的前體添加量以及細胞系中的前體水平對誘導(dǎo)子誘導(dǎo)效果的影響都是決定其產(chǎn)量的因素［8］。

懸浮培養(yǎng)的大豆細胞已廣泛應(yīng)用于細胞生理學、細胞學、發(fā)育學、形態(tài)學、生物生化及分子生物學領(lǐng)域研究。其中主要涉及選擇不同外植體誘導(dǎo)形成大豆細胞懸浮培養(yǎng)體系及外源誘導(dǎo)子誘導(dǎo)調(diào)控細胞合成異黃酮、抗毒素兩個主要環(huán)節(jié)。

1 外植體選擇

植物細胞的懸浮培養(yǎng)中，用于誘導(dǎo)愈傷組織的外植體的選擇是一個重要環(huán)節(jié)。外植體類型、切割長度以及固體愈傷培養(yǎng)基上的放置方式都將影響愈傷的誘導(dǎo)效果［9-10］。大豆愈傷組織誘導(dǎo)常以子葉、子葉節(jié)、下胚軸、胚，少數(shù)采用莖作為外植體，置于固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷，然后將愈傷組織輕微碾碎，轉(zhuǎn)移至含有一定營養(yǎng)成分以及適宜濃度和配比的植物激素的液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度、轉(zhuǎn)速、光照條件、繼代周期下增殖培養(yǎng)。品種、外植體、培養(yǎng)基、溫度、光照、轉(zhuǎn)數(shù)、繼代周期及初次接種愈傷量均為大豆細胞培養(yǎng)成功的影響因素。大豆細胞懸浮培養(yǎng)影響因素多樣，本文以不同的外植體類型對其進行綜述（表1）。

外植體的獲得是愈傷組織誘導(dǎo)的前提，而愈傷組織是細胞懸浮培養(yǎng)的來源。由上述可見，不同的外植體在誘導(dǎo)愈傷組織以及細胞培養(yǎng)時的條件有所不同。品種選擇多樣化，表明品種不是影響細胞成功培養(yǎng)的決定性因素，合適的培養(yǎng)條件更為關(guān)鍵。培養(yǎng)基方面，MS是最常用培養(yǎng)基，也是初次培養(yǎng)大豆細胞的首選，其次可依據(jù)大豆細胞培養(yǎng)出現(xiàn)的問題選擇改良過的MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基或改良過的B5培養(yǎng)基。溫度是影響細胞生長的重要因素之一，通常培養(yǎng)溫度為25℃，由于培養(yǎng)細胞采用的大豆品種不同，個別也選擇21℃或28℃。光照方面主要采用暗培養(yǎng)及16 h/8 h的光照周期培養(yǎng)。此外，轉(zhuǎn)數(shù)也決定細胞生長狀態(tài)，轉(zhuǎn)數(shù)高，細胞容易裂解死亡；轉(zhuǎn)數(shù)低，細胞無法獲得充足氧氣供給，導(dǎo)致生長不良，120 r/min是最常用的培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)，150 r/min應(yīng)用很少。繼代周期也會影響細胞生長速度，周期越長，生長進入穩(wěn)定后期或衰亡期，此時細胞繼代難適應(yīng)新培養(yǎng)基環(huán)境，不利于生長；周期過短，生長處于對數(shù)期，生長快速，繼代會減慢生長速度。因此，大豆細胞繼代周期

一般采用7 d。初次接種愈傷可以通過愈傷塊捏碎轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基，接種量不能過低。

表1 以不同外植體綜述大豆細胞懸浮培養(yǎng)方法

截至目前，大豆細胞培養(yǎng)研究已開展幾十年，然而對影響大豆細胞培養(yǎng)的各個條件仍未有更為細致的研究，如光照，光照周期中光照時間與黑暗時間的比例優(yōu)化未有過研究。再如對細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)選擇未見詳細報道，在生物反應(yīng)器發(fā)展迅速的時代，影響大豆細胞培養(yǎng)的各條件的優(yōu)化篩選決定著能否成功應(yīng)用到生物反應(yīng)器的關(guān)鍵，也是今后研究的一個方向。

2 誘導(dǎo)子調(diào)控細胞合成異黃酮抗毒素

誘導(dǎo)子是以低濃度加入活細胞系統(tǒng)以促進目標化合物合成的物質(zhì)。誘導(dǎo)過程是指誘導(dǎo)子添加后增加代謝目標物生物合成的現(xiàn)象［21］。依據(jù)內(nèi)在屬性，誘導(dǎo)子可劃分為生物誘導(dǎo)子、非生物誘導(dǎo)子。生物誘導(dǎo)子是來源于生物，如分離于植物細胞壁的果膠、纖維素，微生物細胞壁的幾丁質(zhì)、葡聚糖。非生物誘導(dǎo)子是非生命來源的物質(zhì)，尤其是無機鹽及物理因素，如銅、銀、鎘離子，pH值、超聲、紫外線、高靜水壓［22］。根據(jù)來源，也將其分成內(nèi)生誘導(dǎo)子、外生誘導(dǎo)子。內(nèi)生誘導(dǎo)子是來源于胞內(nèi)的物質(zhì)，如海藻膠寡糖、β-葡萄糖苷；外生誘導(dǎo)子指源于胞外，如多糖、多肽、多胺等。研究表明，誘導(dǎo)子能夠引起植物細胞生理及形態(tài)變化，此類常見的誘導(dǎo)子包括非生物性的金屬離子、無機物及生物性的真菌、細菌、植物細胞壁成分以及細胞會產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)，如保護細胞的次生代謝物的合成積累［23］。大豆細胞是具有生物活性的植物化學物質(zhì)的豐富來源，其富含的異黃酮及植保素大豆抗毒素均會在細胞受到外源物誘導(dǎo)刺激下產(chǎn)生變化，這也是誘導(dǎo)子誘導(dǎo)大豆細胞研究中關(guān)注的熱點。

表2 不同前體和誘導(dǎo)子處理對大豆細胞積累大豆異黃酮的影響

2.1 大豆異黃酮

2.1.1 簡介 大豆異黃酮（Soybean Isoflavones，SI）是大豆中一類多酚化合物的總稱，也是一種次生代謝物，廣泛存在于大豆及其制品如豆腐、豆?jié){、豆豉、腐乳等中。大豆異黃酮屬于低分子量水溶性有機物，主要分布在成熟大豆種子的胚軸、子葉及種皮，胚軸中含量最高［24］，主要由染料木素、大豆苷元、黃豆黃素為基本成分以及包括糖苷類、乙?；惡捅；愒趦?nèi)的12種物質(zhì)組成［25］。大豆異黃酮結(jié)構(gòu)與雌激素相似，且具有雌激素類似的作用，因此也稱為植物雌激素［26］。研究表明，大豆異黃酮有多種對人體有益的生物學功能，具有雌激素樣［27］，抗氧化［28］、抗腫瘤［29］、降低膽固醇［30］等作用。

2.1.2 外源物誘導(dǎo)調(diào)控細胞合成大豆異黃酮 近幾十年來，應(yīng)用前體和外源物處理大豆懸浮培養(yǎng)細胞增加大豆異黃酮合成有諸多研究（表2）。研究表明，大豆細胞受到DMSO、茉莉酸甲酯等非生物誘導(dǎo)物，物理因素脈沖電場以及通過改變添加到培養(yǎng)基中激素的濃度配比時，大豆總異黃酮含量明顯增加，這主要是由于外源誘導(dǎo)物以及培養(yǎng)環(huán)境中不同激素濃度對大豆異黃酮的代謝合成路徑中有關(guān)酶合成或活性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致某些異黃酮含量也相應(yīng)發(fā)生改變。此外，苯丙氨酸作為大豆異黃酮的前體物質(zhì)［34］，給細胞系添加適量后，增加異黃酮代謝途徑中的原料來源，有助于增加胞內(nèi)異黃酮的積累量。

2.2 大豆抗毒素

2.2.1 簡介 大豆抗毒素（Glyceollins，Gly）是植物受到外界環(huán)境壓力后重新合成和積累的一類低分子量的植物抗毒素［35］，也是一類可經(jīng)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的異戊烯化的異黃酮和植物雌激素［34］，具有益于人體健康的重要生物學特性［36］，其主要以3種同分異構(gòu)體的形式存在，即大豆抗毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（圖1），其他不常見的異構(gòu)體包括大豆抗毒素Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和glyceofuran［37］。研究表明，大豆抗毒素是能與雌激素受體（ER）相結(jié)合的抗雌激素物質(zhì)，抑制雌激素誘導(dǎo)的腫瘤進程，其中大豆抗毒素Ⅰ抗雌激素活性最強［38］。大量研究結(jié)果也顯示，大豆抗毒素在促進人體健康方面發(fā)揮著重要作用，主要具有抗雌激素［39］、抗癌［40］、免疫抑制［41］、葡萄糖［42］和脂肪調(diào)節(jié)［43］、抗菌［44］、抗氧化［45］等多種臨床前的特性。此外，大豆抗毒素在生物學特性上具體表現(xiàn)為抵抗雌激素依賴型的癌細胞的生長和增殖，調(diào)節(jié)葡萄糖、能量代謝、微生物生長和人體發(fā)病、炎癥反應(yīng)、氧化引發(fā)的細胞衰老等，還可用在皮膚美白［46］和血管健康維護［47］方面。

圖1 大豆抗毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ結(jié)構(gòu)

2.2.2 外源物誘導(dǎo)調(diào)控細胞合成大豆抗毒素 有研究表明，采用細菌、真菌以及其細胞壁提取物、寡糖及其他種類外源誘導(dǎo)物，在適當外界環(huán)境下，通過適宜的處理濃度能夠誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)的大豆細胞合成大豆抗毒素，而誘導(dǎo)個別品種大豆細胞未合成大豆抗毒素（表3）。

大豆苷元是胞內(nèi)大豆抗毒素合成的前體物質(zhì)［53］。研究顯示，Mandarin品種大豆細胞系Sb-1含低水平的大豆苷元，感染丁香假單胞菌A-29-2、2159以及致病疫霉真菌后，大豆苷元和染料木素含量均未有減少，僅合成極少量大豆抗毒素。這主要因為胞內(nèi)低含量的前體物質(zhì)大豆苷元限制其合成。含有高水平的異黃酮，尤其高含量大豆苷元的Mandarin Sb-2、Sb-4細胞暴露于致病疫霉真菌，胞內(nèi)大豆苷元、染料木素含量顯著降低，且合成大豆抗毒素［48］。該結(jié)果表明，誘導(dǎo)子處理前細胞系的前體物質(zhì)大豆苷元含量影響大豆抗毒素合成。

還有研究報道，未被誘導(dǎo)處理的正常大豆細胞中的大豆抗毒素含量極其低［49］，只有采用合適的外源誘導(dǎo)子對細胞產(chǎn)生刺激后，才可能促進細胞合成提高大豆抗毒素積累量。目前，調(diào)控大豆細胞合成異黃酮及抗毒素的誘導(dǎo)物以細菌、真菌培養(yǎng)濾液、微生物細胞壁提取物及重金屬離子為主，而直接利用工業(yè)上生產(chǎn)的寡糖作為外源誘導(dǎo)子的研究還相對較少。細菌、真菌培養(yǎng)濾液及微生物細胞壁提取物的制備處理相對繁瑣，耗費時間、人力、物力，容易降低誘導(dǎo)效率，且它們的制取方式容易對人體健康產(chǎn)生隱患。再者，菌培養(yǎng)濾液、細胞壁提取物成分復(fù)雜，用于誘導(dǎo)大豆細胞很大程度對細胞中生物活性物質(zhì)的提取產(chǎn)生干擾。重金屬離子誘導(dǎo)細胞的弊端在于離子吸附在大豆細胞表面，它們普遍存在生物活性物質(zhì)的粗提液中，不易除去。盡管如此，上述誘導(dǎo)子仍可在一定條件下用于誘導(dǎo)大豆細胞。然而，采用寡糖誘導(dǎo)子誘導(dǎo)細胞的過程不會對人體健康產(chǎn)生任何危害，而且寡糖大多是一類功能性糖［54］，因此用其處理大豆細胞合成異黃酮及抗毒素是今后值得期待的研究方向。

表3 不同誘導(dǎo)子處理對大豆細胞合成大豆抗毒素的影響

3 展望

傳統(tǒng)的外源物誘導(dǎo)大豆細胞模式均采用單一誘導(dǎo)子，如真菌、細菌培養(yǎng)濾液、微生物細胞壁提取物、寡糖以及重金屬離子等。然而，最新研究發(fā)現(xiàn)，采用復(fù)合誘導(dǎo)子誘導(dǎo)處理其他植物細胞時可以合成更高含量的生物活性物質(zhì)，這可能得益于復(fù)合誘導(dǎo)子具有協(xié)同增效的作用，起到增強誘導(dǎo)能力的效果。Zhao等［55］指出，與單一誘導(dǎo)子相比，通過復(fù)合誘導(dǎo)子真菌制備物和四甲基溴化銨以及蘋果酸和海藻酸鈉分別處理細胞均可提高阿瑪堿和長春堿積累量。另外，Almagro等［56］采用單一或復(fù)合誘導(dǎo)子誘導(dǎo)處理懸浮培養(yǎng)的亞麻細胞合成生育酚的研究發(fā)現(xiàn)，50 mmol/L羥丙基化β-環(huán)糊精分別與1 mg/L β-葡聚糖和40 μmol/L己烯醇復(fù)合誘導(dǎo)可產(chǎn)生174 μg/g生育酚和257 μg/g細胞干重，高于單一誘導(dǎo)子處理細胞后生育酚的積累量。然而，傳統(tǒng)的誘導(dǎo)調(diào)控大豆細胞合成異黃酮及大豆抗毒素的誘導(dǎo)子均為單一誘導(dǎo)子，應(yīng)用復(fù)合誘導(dǎo)子處理大豆細胞的研究至今尚無，其處理大豆細胞的誘導(dǎo)效果還處于未知階段。因此，采用復(fù)合誘導(dǎo)子刺激大豆細胞調(diào)控合成異黃酮及抗毒素會是一個新的研究方向。

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（責任編輯 楊賢智）

Advances in suspension-cultured methods of soybean cell and accumulation on soybean isoflavones and glyceollins from cell exposed to elicitor

WANG Kai-qiang，PENG Qing，QIAO Yu，DING Hui，XU Xiao-qing，ZHANG Yu-wei，WEI Chen-yang，SHI Bo
（Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China）

Suspension-cultured cell technique which developed soybean cell and aggregates in liquid medium，has been extensively applied in numerous fields. The paper summarized the methods for suspension-cultured soybean cell employing different explants，including cotyledon，cotyledon node，hypocotyl，immature embryo and stem，inducible effect of exogenous elicitors and precursor treatment on accumulation of isoflavones and influence of elicitors exposure to soybean cell on synthesis and accumulation of glyceollins. Soybean isoflavones and glyceollins are two types of bioactive secondary metabolites produced from soybean. On the basis，the present problems were illustrated and prospective development directions were also recommended for the propose of providing ideas concerning higher level of isoflavones and glyceollins accumulation produced by cell in response to other optional elicitors.

soybean；cell suspension-cultured；elicitor；elicition；soybean isoflavones；glyceollins

S565.1

A

1004-874X（2017）03-0030-09

2016-12-25

國家自然科學基金（31171628）

王凱強（1988-），男，在讀博士生，E-mail：1064645257@qq.com

石波（1964-），男，博士，研究員，E-mail：shibo@caas.cn

王凱強，彭晴，喬宇，等. 大豆細胞懸浮培養(yǎng)及其大豆異黃酮和抗毒素誘導(dǎo)積累研究進展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（3）：30-38.