趙進(jìn)輝，李 耀，袁海超，劉木華

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院 生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

鴨肉中環(huán)丙沙星殘留的表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)定

趙進(jìn)輝，李 耀，袁海超，劉木華*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院 生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

為實(shí)現(xiàn)鴨肉中環(huán)丙沙星(CIP)殘留的快速檢測(cè)，建立了一種鴨肉中CIP殘留的表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)快速檢測(cè)方法。進(jìn)行了增強(qiáng)基底的紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析和鴨肉中CIP殘留檢測(cè)的SERS可行性分析。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定了金膠加入量、含CIP的鴨肉提取液加入量、氯化鈉溶液加入量和吸附時(shí)間。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，建立了鴨肉中CIP殘留的SERS檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，決定系數(shù)(R2)為0.987 9，預(yù)測(cè)樣本中CIP的平均回收率為97.0% ～111.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鴨肉中CIP殘留的SERS快速檢測(cè)方法是可行的。

環(huán)丙沙星；表面增強(qiáng)拉曼光譜；鴨肉；檢測(cè)

環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)是一種第三代喹諾酮類廣譜抗生素，因具有較好的殺菌效果，在禽養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用。但由于對(duì)其的不合理使用，常造成禽肉中CIP殘留超標(biāo)，可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒副作用(如胸悶、頭暈、腎臟損傷等)。目前用于CIP殘留的檢測(cè)方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、電化學(xué)法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[1-5]，但是這些方法不能滿足鴨肉中CIP殘留的快速檢測(cè)要求。因此，尋找一種鴨肉中CIP殘留的快速檢測(cè)方法是目前亟待解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)作為一種具有高靈敏性的快速檢測(cè)方法已用于獸藥殘留檢測(cè)[6]。馬海寬等[7-8]對(duì)魚(yú)肉中的磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶進(jìn)行了SERS檢測(cè)與分析。Zhao等分別對(duì)鴨肉中的螺旋霉素[9]和四環(huán)素[10]殘留進(jìn)行了SERS檢測(cè)分析。Ji等[11]應(yīng)用SERS技術(shù)檢測(cè)了豬肉、牛肉、雞等食品中的氯霉素殘留。Han等[12]對(duì)自來(lái)水、湖水和土壤等樣本中甲硝唑和羅硝唑進(jìn)行了SERS檢測(cè)分析。但尚未見(jiàn)基于SERS技術(shù)的鴨肉中CIP的殘留檢測(cè)報(bào)道。本研究以金納米顆粒作為增強(qiáng)試劑，建立了一種鴨肉中CIP殘留的SERS快速檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用麻鴨購(gòu)于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場(chǎng)；CIP標(biāo)準(zhǔn)品(純度約為99.0%)購(gòu)于南昌精科科學(xué)儀器有限公司；氯金酸(HAuCl4·3H2O，M=393.83，其中金含量為≥49.0%，Sigma-Aldrich公司)；乙酸乙酯、檸檬酸三鈉(分析純，汕頭西隴化工股份有限公司)；氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉為分析純(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 儀器設(shè)備

QE65000便攜式拉曼光譜儀(海洋光學(xué)有限公司)；T10型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(湖南科爾頓水務(wù)有限公司；DL-1電子萬(wàn)用爐(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；JJ-2B型組織搗碎勻漿機(jī)(江蘇省金壇市金南儀器廠)；JK-50B 型超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械有限公司)；FA1004B型電子天平(精度為0.1 mg，上海上平儀器有限公司)；HSC-24B型氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；VORTEX-5旋渦混合器(海門(mén)市其林貝爾儀器有限公司)；JW-1024低速離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器責(zé)任有限公司)；石英進(jìn)樣瓶(北京成騰器材有限公司)；石英比色皿(1 cm光程)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用檸檬酸三鈉還原法制備金膠納米粒子[13]。將2 mL 1%的氯金酸加至500 mL燒杯中，用水定容至200 mL，用電子萬(wàn)用爐將其加熱至沸騰，加1 mL 1%的檸檬酸三鈉。繼續(xù)加熱約8 min直至溶液顏色變紫紅色后，冷卻至室溫，4 ℃保存。

將5 g 搗碎的鴨肉和6.5 g無(wú)水硫酸鈉加至50 mL離心管中，然后加入15 mL乙酸乙酯并渦旋1 min，超聲振蕩10 min，離心(3 000 r/min) 5 min，取上清液。重復(fù)提取1次，合并2次提取液，將其用氮?dú)獯蹈珊蠹尤肱c氮吹前等量的水，再用快速濾紙過(guò)濾得到鴨肉提取液。稱取5 mg的CIP標(biāo)準(zhǔn)品溶于一定體積的鴨肉提取液中，超聲溶解定容后得到含100 mg/L CIP的鴨肉提取液加標(biāo)樣本，然后用鴨肉提取液將其稀釋，得到含不同濃度CIP的鴨肉提取液加標(biāo)樣本。

將10 mg CIP標(biāo)準(zhǔn)品超聲溶解于100 mL水中，得到100 mg/L的CIP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后將其用水稀釋得不同濃度的CIP標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

稱取0.528 g的氯化鈉溶于100 mL水中，得到0.1 mol/L的氯化鈉溶液。

向2 mL的石英進(jìn)樣瓶中依次加入金膠500 μL、含不同濃度CIP的鴨肉提取液加標(biāo)樣本15 μL和氯化鈉溶液120 μL，混合均勻后放入樣品池中進(jìn)行SERS光譜采集。其中，拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置為：光譜儀激光功率500 mW，激光波長(zhǎng)785 nm，積分時(shí)間10 s，積分平均2次，并選擇波段為400～1 800 cm-1的SERS光譜進(jìn)行研究。

通過(guò)單因素分析，優(yōu)化如下4個(gè)實(shí)驗(yàn)條件：金膠加入量，含CIP的鴨肉提取液加入量，氯化鈉溶液加入量和吸附時(shí)間。于最佳實(shí)驗(yàn)條件下，分別采集不同濃度的CIP標(biāo)準(zhǔn)品溶液和含不同濃度CIP的鴨肉提取液加標(biāo)溶液的SERS光譜。上述所有樣本的光譜均采集3次，取3次測(cè)量的平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在鴨肉中CIP殘留的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線建立與預(yù)測(cè)前，先用自適應(yīng)迭代重加權(quán)懲罰最小二乘算法扣除熒光等背景信號(hào)。

2 結(jié)果與討論

2.1 增強(qiáng)基底的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

將500 μL自制金膠加1 mL水稀釋，得到如圖1a所示的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，從曲線a可知，本研究自制金膠的最大吸收峰約在542 nm處，半峰寬約為84 nm。將500 μL金膠、15 μL鴨肉提取液加標(biāo)樣本與120 μL氯化鈉溶液混合，再加入1 mL超純水稀釋，采集得到的紫外-可見(jiàn)吸收光譜如圖1b所示，由圖可見(jiàn)，金膠和CIP分子吸附后，引起了金納米溶膠的粒徑發(fā)生變化，相比曲線a，其最大吸收峰發(fā)生8 nm紅移，峰形變得更寬。這可能是因?yàn)镃IP分子吸附金膠粒子后，改變了金膠納米粒子表面的等離子共振而引起的[14]。

圖1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectra a.gold colloid；b.gold colloid + duck meat extract containing CIP(5 mg/L)+NaCl

圖2 不同溶液的SERS光譜Fig.2 SERS spectra of different solutions a.duck meat extract；b.ultrapure water；c.conventional Raman spectrum of duck meat extract containing CIP (5 mg/L)；d.CIP solution(5 mg/L)；e.duck meat extract containing CIP(5 mg/L)

2.2 鴨肉中CIP殘留檢測(cè)的SERS可行性分析

分別采集鴨肉提取液樣本、水、CIP標(biāo)準(zhǔn)品溶液和含CIP的鴨肉提取液樣本的SERS，以及含CIP的鴨肉提取液樣本的普通拉曼光譜，并將所得數(shù)據(jù)繪制成如圖2所示的曲線。由曲線b可知，水的SERS光譜基本未呈現(xiàn)明顯的峰強(qiáng)；對(duì)比CIP標(biāo)準(zhǔn)品溶液的SERS數(shù)據(jù)(曲線d)，可以看出CIP標(biāo)準(zhǔn)品溶液在位于1 142，1 195，1 262，1 331，1 390 cm-1處均出現(xiàn)較明顯且突出的SERS峰，且1 262 cm-1處的SERS峰強(qiáng)度最大，可考慮將此處SERS峰作為檢測(cè)CIP的參考特征峰。比較光譜曲線d和e可知，在含CIP的鴨肉提取液樣本的SERS曲線中，1 142，1 195，1 262，1 331，1 390 cm-1處得到與曲線d類似的譜峰，而對(duì)比鴨肉提取液樣本的SERS數(shù)據(jù)，曲線a在這些位置未出現(xiàn)SERS峰，進(jìn)一步驗(yàn)證了以1 262 cm-1處所得拉曼峰作為檢測(cè)鴨肉中CIP的特征峰是可靠的。考察自制金膠的增強(qiáng)效果，比較曲線c和e可以看出，未加基底所得含CIP的鴨肉提取液樣本的拉曼光譜基本為一條平滑曲線；在加入金膠和氯化鈉后測(cè)得的拉曼光譜曲線e上所得峰值明顯增多，且特征峰的峰強(qiáng)也有較大增強(qiáng)，說(shuō)明了金膠基底對(duì)拉曼光譜的增強(qiáng)作用。

2.3 金膠加入量對(duì)SERS信號(hào)的影響

以金膠作為SERS光譜的增強(qiáng)基底，金膠的加入量直接影響鴨肉中CIP的SERS增強(qiáng)效果。本研究分別以不同加入量的金膠(200，300，500，700，900 μL)與15 μL鴨肉提取液加標(biāo)樣本(5 mg/L)和120 μL氯化鈉溶液混合，采集這些樣本的SERS光譜數(shù)據(jù)，考察不同的金膠加入量對(duì)特征峰1 262 cm-1處SERS信號(hào)強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，1 262 cm-1處SERS信號(hào)強(qiáng)度隨金膠加入量的增加呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，在金膠加入量為500 μL時(shí)SERS特征峰的峰強(qiáng)最強(qiáng)，獲得較佳的SERS信號(hào)強(qiáng)度。因此，確定金膠的加入量為500 μL。

2.4 含CIP的鴨肉提取液加入量對(duì)SERS信號(hào)的影響

含CIP的鴨肉提取液的加入量會(huì)影響鴨肉提取液中CIP 的SERS特征峰強(qiáng)度。本研究在500 μL金膠中，分別加入5，10，15，20，30 μL含CIP的鴨肉提取液(CIP濃度5 mg/L)和120 μL氯化鈉溶液，混合后采集SERS光譜。結(jié)果顯示，1 262 cm-1處SERS信號(hào)強(qiáng)度隨含CIP的鴨肉提取液加入量的增加呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，其加入量為15 μL時(shí)特征峰的峰強(qiáng)最大。此外，含CIP的鴨肉提取液加入量不同時(shí)，所得特征峰的峰強(qiáng)最大差值超過(guò)10 000 a.u.，很好地說(shuō)明特征峰峰值受到含CIP的鴨肉提取液加入量的影響很大。因此確定實(shí)驗(yàn)中含CIP的鴨肉提取液最佳加入量為15 μL。

2.5 氯化鈉溶液加入量對(duì)SERS信號(hào)的影響

氯化鈉的加入量會(huì)影響金膠納米粒子的凝聚程度，在SERS光譜中起活化和誘導(dǎo)作用，會(huì)對(duì)SERS信號(hào)的增強(qiáng)產(chǎn)生一定的影響。本實(shí)驗(yàn)以500 μL自制金膠作為增強(qiáng)基底，選取15 μL含5 mg/L CIP 的鴨肉提取液加標(biāo)樣本，再分別加入50，70，100，120，150 μL的氯化鈉溶液，采集其各自的SERS光譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氯化鈉溶液加入量為120 μL時(shí)，1 262 cm-1處特征峰的峰強(qiáng)達(dá)到最高。繼續(xù)增大氯化鈉溶液加入量時(shí)，過(guò)量的氯化鈉分子可能會(huì)引發(fā)金膠納米粒子的團(tuán)聚，使得特征峰峰強(qiáng)降低。由此確定氯化鈉溶液的加入量為120 μL。

2.6 吸附時(shí)間對(duì)SERS信號(hào)的影響

吸附時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響到鴨肉提取液中CIP分子在金納米顆?；钚员砻娴臄?shù)量，進(jìn)而影響到鴨肉提取液中CIP的SERS特征峰強(qiáng)度[9-10]。本研究在金膠、待測(cè)液和氯化鈉最佳加入量條件下考察了吸附時(shí)間的影響。結(jié)果顯示，在1 min反應(yīng)時(shí)間后，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，1 262 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度逐步變小。表明在1 min時(shí)1 262 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度最強(qiáng)，由此說(shuō)明鴨肉提取液中CIP分子在與金膠反應(yīng)1 min時(shí)可達(dá)到較佳的活性熱點(diǎn)，此時(shí)的光譜增強(qiáng)效果較佳。在1 min后，金膠納米粒子與待測(cè)液的分子可能出現(xiàn)了聚沉現(xiàn)象，使得1 262 cm-1處拉曼峰強(qiáng)度降低。由此確定最佳吸附時(shí)間為1 min。

2.7 鴨肉中CIP檢測(cè)的SERS定量分析

采集CIP濃度在0.2～7.0 mg/L范圍內(nèi)的鴨肉提取液加標(biāo)樣本的SERS信號(hào)，根據(jù)特征峰1 262 cm-1處測(cè)得的峰強(qiáng)，分析了鴨肉提取液中CIP濃度與1 262 cm-1處特征峰強(qiáng)度之間的關(guān)系，并以鴨肉提取液中CIP的濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)，特征峰處測(cè)得的SERS強(qiáng)度(y)為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，得回歸方程為y=2 589.3x-894.39，決定系數(shù)(R2)為0.987 9。表明鴨肉提取液中的CIP濃度在0.2～7.0 mg/L范圍內(nèi)與1 262 cm-1處峰強(qiáng)呈良好的線性關(guān)系。

為了考察SERS技術(shù)檢測(cè)鴨肉提取液中CIP殘留量的可靠性，利用所得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程，對(duì)CIP濃度為1.5，3.0，4.0，4.5，6.0 mg/L的樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)。根據(jù)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到預(yù)測(cè)樣本中CIP的平均回收率分別為99.1%，111.7%，97.0%，97.8%，98.6%，說(shuō)明采用該方法檢測(cè)鴨肉中CIP殘留量準(zhǔn)確有效，有利于實(shí)現(xiàn)鴨肉中CIP殘留的快速檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本研究進(jìn)行了增強(qiáng)基底的紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析以及鴨肉中CIP殘留檢測(cè)的SERS可行性分析，為鴨肉中CIP殘留的SERS檢測(cè)提供了依據(jù)。通過(guò)單因素分析，確定了金膠加入量、含CIP的鴨肉提取液加入量、氯化鈉溶液加入量及最佳吸附時(shí)間。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下建立了鴨肉中CIP殘留的SERS檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到R2為0.987 9，預(yù)測(cè)樣本中CIP的平均回收率為97.0%～111.7%。

[1] Cai Z，Gan B B，Li S G，Zhao J.Technol.Dev.Chem.Ind.(蔡卓，甘賓賓，李斯光，趙靜.化工技術(shù)與開(kāi)發(fā))，2007，12：24-27，7.

[2] Cao Y，Jiang Y.Chin.J.Veter.Drug(曹瑩，蔣音.中國(guó)獸藥雜志)，2012，6：27-29.

[3] Li X L，Huang X R，Wan Y W，Chen X Y.ChineseFisheryQualityandStandards(李小玲，黃向榮，萬(wàn)譯文，陳湘藝.中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn))，2013，4：25-30.

[4] Gao B.PreparationandComputationalSimulationofMolecularlyImprintedPolymerswithOpticalandElectrochemicalProperies.Changchun:Jilin University(高波.分子印跡光學(xué)與電化學(xué)傳感材料的制備與計(jì)算機(jī)模擬.長(zhǎng)春：吉林大學(xué))，2015.

[5] Ju L Y，Song X H，Gu J，Xu C G，Yang L J.J.Instrum.Anal.(鞠玲燕，宋曉華，谷婕，徐成鋼，楊麗君.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2016，35(6)：714-718.

[6] Wang X T ，Shi W S，She G W，Mu L X，Lee S T.Appl.Phys.Lett.，2010，96(5):053104.

[7] Ma H K，Han X H，Zhang C H，Zhang X，Shi X F，Ma J.ActaLaserBiol.Sin.(馬海寬，韓曉紅，張財(cái)華，張旭，史曉鳳，馬君.激光生物學(xué)報(bào) )，2014,23(6):560-565.

[8] Li C Y，Huang Y Q，Lai K Q， Rasco Barbara A，F(xiàn)an Y X.FoodControl，2016,65:99-105.

[9] Hong Q，Liu M H，Yuan H C，Peng Y J，Li Y，Zhao J H.Chin.J.Lumin.(洪茜，劉木華，袁海超，彭義杰，李耀，趙進(jìn)輝.發(fā)光學(xué)報(bào))，2015，36( 12):1464-1468.

[10] Zhao J H，Liu P，Yuan H C，Peng Y J，Hong Q，Liu M H.J.Spectrosc.，2016，2016：1845237.

[11] Ji W，Yao W R.Spectrochim.ActaA，2015，144:125-130.

[12] Han C Q，Chen J,Wu X M,Huang X W,Zhao Y P.Talanta，2014,128:293-298.

[13] Liu P，He B X,Huang Y F.China Patent(劉平,何寶祥,黃云飛.中國(guó)專利)，201310674116.9.2013-12-11.

[14] Zhang Q，Weng Y X.J.LightScatter(張權(quán)，翁羽翔.光散射學(xué)報(bào))，2015，27(1):1-8.

Detection of Ciprofloxacin Residues in Duck Meat Using Surface Enhanced Raman Spectroscopy

ZHAO Jin-hui，LI Yao，YUAN Hai-chao，LIU Mu-hua*

(Optics-Electrics Application of Biomaterials Lab，College of Engineering,Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China)

A rapid detection method of surface enhanced Raman spectroscopy(SERS) was established for the detection of ciprofloxacin (CIP) residues in duck meat.UV-visible absorption spectrum of SERS enhanced substrate and the feasibility of SERS detection of CIP residues in duck meat were analyzed.The addition amount of gold colloid， addition amount of duck meat extract containing CIP，addition amount of sodium chloride solution and the adsorption time were optimized by the single factor analysis.The calibration curve for the method was obtained in the optimum experiment condition.The determination coefficient was 0.987 9.The average recoveries of CIP in the prediction samples were between 97.0% and 111.7%.The experiment results indicated that the SERS method was feasible for the detection of CIP residues in duck meat.

ciprofloxacin(CIP)；surface enhanced Raman spectroscopy(SERS)；duck meat；detection

2016-12-11；

2017-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31660485)；江西省科技廳對(duì)外科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(20132BDH80005)；江西省科技廳科技支撐項(xiàng)目(20121BBG70058)；江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(GJJ12244)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.023

O657.3；TQ460.72

A

1004-4957(2017)05-0701-04

*通訊作者：劉木華，博士，教授，研究方向：光譜分析與檢測(cè)，Tel:0791-83813260，E-mail：suikelmh@sohu.com