張引紅，王春芳，郭 民，張銳虎，陳朝陽(yáng)

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

研究報(bào)告

宮腔注射無(wú)水乙醇對(duì)小鼠動(dòng)情周期的影響

張引紅，王春芳，郭 民，張銳虎，陳朝陽(yáng)*

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

目的 探討宮腔內(nèi)注射無(wú)水乙醇對(duì)小鼠動(dòng)情周期的影響。方法 利用陰道脫落細(xì)胞染色法選擇動(dòng)情期規(guī)律的小鼠20只，宮腔注射無(wú)水乙醇，術(shù)后第一個(gè)動(dòng)情周期內(nèi)每日測(cè)定其動(dòng)情周期，隨機(jī)擇10只在第二個(gè)動(dòng)情周期每2 h測(cè)一次，觀察動(dòng)情周期的改變程度。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)小鼠宮腔注射無(wú)水乙醇后動(dòng)情周期整體發(fā)生大幅度延長(zhǎng)，且動(dòng)情期、動(dòng)情前期等各期時(shí)間均發(fā)生了不同程度的紊亂。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀測(cè)無(wú)水乙醇損傷子宮后小鼠動(dòng)情周期發(fā)生紊亂的現(xiàn)象，為臨床無(wú)水乙醇的使用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

無(wú)水乙醇；宮腔注射；動(dòng)情周期

作為一種采購(gòu)方便、價(jià)格低廉且無(wú)毒的化學(xué)試劑，乙醇因其對(duì)細(xì)胞、組織的脫水和蛋白質(zhì)變性作用在科研實(shí)驗(yàn)及臨床中被廣泛應(yīng)用[1]。臨床治療中，常常利用無(wú)水乙醇直接接觸異位、增生等異常的組織或器官進(jìn)行損傷以達(dá)到治療目的，尤以生殖系統(tǒng)疾病最為常見(jiàn)，如子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜異位、卵巢囊腫，以及子宮內(nèi)膜炎引起的子宮內(nèi)膜異常出血等[2,3]。但針對(duì)無(wú)水乙醇在治療過(guò)程中可能對(duì)生殖系統(tǒng)帶來(lái)的傷害，對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)可能存在的影響，暫無(wú)人進(jìn)一步研究。規(guī)律的動(dòng)情期作為小鼠生殖系統(tǒng)正常的一個(gè)重要指標(biāo)，有著不可忽視的意義。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀測(cè)無(wú)水乙醇損傷子宮后小鼠動(dòng)情期變化，為臨床無(wú)水乙醇的使用提供一定的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J小鼠，SPF級(jí)，雌性，6～8周齡，體重20～22 g，20只，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(晉)2015-0001]。飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(晉)2015-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(25±2)℃和濕度(55±2)%，自由采食飲水，光照/黑暗各12 h。

1.2 主要試劑與儀器

無(wú)水乙醇(北京化工廠);醇溶性伊紅染液(上海榕柏生物技術(shù)有限公司);戊巴比妥鈉(Ceres Chemical);生理鹽水(山東華魯制藥有限公司);研究級(jí)正置顯微鏡(Olympus IX51)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠動(dòng)情周期觀察

每日上午8∶00做陰道脫落細(xì)胞涂片檢查。將裝有生理鹽水的一次性灌胃針輕輕插入到小鼠陰道口，注入0.1 mL生理鹽水沖洗陰道，用載玻片接取溢出的陰道沖洗液，并涂抹均勻，晾干。用95%乙醇固定5 min，伊紅染色液染色l min[1]。200倍光鏡觀察陰道脫落細(xì)胞染色情況并記錄。連續(xù)觀察三個(gè)動(dòng)情周期。剔除動(dòng)情期不規(guī)律者。

1.3.2 宮腔灌注無(wú)水乙醇實(shí)驗(yàn)

擇動(dòng)情期規(guī)律小鼠在動(dòng)情期當(dāng)日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用1.5 %戊巴比妥鈉麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，劑量為75 mg/kg。將小鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，75%乙醇對(duì)小鼠腹部進(jìn)行消毒，尿道口上端約1 cm處縱行剪開(kāi)皮膚，切口約1 cm。逐層分離進(jìn)入腹腔。撥離膀胱，可見(jiàn)Y狀子宮。用無(wú)齒鑷將子宮暴露于體外，周圍覆蓋無(wú)菌紗布。將子宮近輸卵管端及近子宮頸端分別用血管夾夾住，拉直子宮，從近宮頸口插入1 mL注射器針頭，緩慢注射無(wú)水乙醇至子宮充盈，等候3 min，吸走乙醇。恢復(fù)子宮位置，用生理鹽水沖洗腹腔。取出另一側(cè)子宮，操作同上。關(guān)腹，逐層縫合[1]。

1.3.3 結(jié)果觀察

術(shù)后次日繼續(xù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)小鼠動(dòng)情周期，測(cè)定時(shí)間依舊為每日上午8∶00，測(cè)定頻率為每日一次，將各期觀察到的次數(shù)作為存在天數(shù)并記錄。分析記錄與術(shù)前動(dòng)情周期及相關(guān)文獻(xiàn)[8]持續(xù)時(shí)間的區(qū)別及各期變化。

參考第一周測(cè)定結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)記錄，隨機(jī)選擇10只小鼠將動(dòng)情周期測(cè)定時(shí)間變更為每2 h測(cè)一次(計(jì)數(shù)方法為測(cè)到一次算2 h)，進(jìn)一步明確各期變化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠動(dòng)情周期

小鼠具有規(guī)律的動(dòng)情周期，約為4～5 d,周期內(nèi)各期特征如下：(1)動(dòng)情前期：大多為橢圓形的有核上皮細(xì)胞(見(jiàn)圖1A)，持續(xù)時(shí)間較短；(2)動(dòng)情期∶90%以上為無(wú)核角化細(xì)胞(見(jiàn)圖1B)；(3)動(dòng)情后期：為無(wú)核角化細(xì)胞和白細(xì)胞的混合狀態(tài)(見(jiàn)圖1C)；(4)動(dòng)情間期∶90%以上為白細(xì)胞(見(jiàn)圖1D)。

2.2 術(shù)后小鼠周期狀況

2.2.1 術(shù)后第一個(gè)動(dòng)情周期內(nèi)狀態(tài)

計(jì)數(shù)方法為觀察到一次算為1 d。

術(shù)后小鼠最明顯的狀況為大部分動(dòng)情期延長(zhǎng)至2～3 d，個(gè)別甚至高達(dá)4～5 d，導(dǎo)致整體的動(dòng)情周期被大幅度延遲。另外，術(shù)后動(dòng)情周期比較紊亂，大部分小鼠動(dòng)情后期出現(xiàn)2～3 d，超過(guò)文獻(xiàn)記錄[8]12 h；1只小鼠在經(jīng)歷了3 d動(dòng)情期和3 d動(dòng)情后期后，跳過(guò)動(dòng)情間期和動(dòng)情前期，直接進(jìn)入新的動(dòng)情期；四分之一的小鼠連續(xù)4～5 d處于動(dòng)情間期；超過(guò)二分之一的小鼠動(dòng)情后期結(jié)束越過(guò)動(dòng)情前期，直接進(jìn)入動(dòng)情間期。具體情況參見(jiàn)表1。

2.2.2 術(shù)后第二個(gè)動(dòng)情周期狀況

術(shù)后第二個(gè)動(dòng)情周期開(kāi)始，隨機(jī)選擇10只小鼠每隔2 h測(cè)定一次動(dòng)情周期并記錄。發(fā)現(xiàn)術(shù)后動(dòng)情期、動(dòng)情后期均存在不同程度的時(shí)間延長(zhǎng)，尤以動(dòng)情期延長(zhǎng)最為明顯。另外也觀察到大部分小鼠的動(dòng)情前期還是存在的，只是比文獻(xiàn)顯示時(shí)間相對(duì)縮短，因此測(cè)定頻率較低的時(shí)候容易錯(cuò)過(guò)。也有個(gè)別小鼠未觀察到動(dòng)情期。具體情況參見(jiàn)表2。

3 討論

無(wú)水乙醇能使細(xì)胞脫水，細(xì)胞膜蛋白質(zhì)變性、凝固、壞死，臨床上廣泛的用于治療月經(jīng)過(guò)多、子宮內(nèi)膜增生、子宮肌瘤、卵巢囊腫、甲狀腺結(jié)節(jié)、肝腎囊腫、肝癌及肺癌等[2-7]。同時(shí)，臨床治療中無(wú)水乙醇使用對(duì)醫(yī)療設(shè)備配置、醫(yī)護(hù)人員技能均要求較低，治療費(fèi)用較少，安全性容易控制，因此得到了患者及醫(yī)生的普遍認(rèn)可并逐步成為首選[13]。

注：(A)動(dòng)情前期；(B)動(dòng)情期；(C)動(dòng)情后期；(D)動(dòng)情間期。圖1 小鼠不同動(dòng)情周期陰道涂片(×200)Note.(A)Preoestrus stage；(B)Estrus stage；(C)Meterus stage；(D)Diestrus stage.Fig.1 Vaginal smears of the mice at different stages of estrous cycle

鼠號(hào)Number動(dòng)情期Estrusstage動(dòng)情后期Meterusstage動(dòng)情間期Diestrusstage動(dòng)情前期Preoestrusstage動(dòng)情周期Estruscycle141207232319332308421508533006631509742208823308921407105131101133208123240913413191432207153230816232181722408183230819312172031318

表2 術(shù)后第二個(gè)動(dòng)情周期狀況(h)

周云清等[10]在良性月經(jīng)過(guò)多患者宮腔內(nèi)注射無(wú)水乙醇的方法，達(dá)到減少月經(jīng)量，迅速止血的效果。該方法操作簡(jiǎn)單、療效高，且不需要特殊的儀器及操作訓(xùn)練。但該方法的遠(yuǎn)期療效、副作用、復(fù)發(fā)率、失敗原因等也都需要進(jìn)一步探討。劉家開(kāi)等[11]在超聲介導(dǎo)下通過(guò)腹部穿刺注射無(wú)水乙醇對(duì)卵巢囊腫患者進(jìn)行治療，成功率高達(dá)98%，術(shù)后并發(fā)癥及復(fù)發(fā)率均較低。李秀娥等[12]在超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮下子宮肌瘤內(nèi)注射無(wú)水乙醇，分別在術(shù)后6個(gè)月、12個(gè)月觀察子宮體積、肌瘤體積、內(nèi)部血流臨床癥狀等，發(fā)現(xiàn)子宮體積、肌瘤體積縮小，肌瘤內(nèi)部及周邊血流明顯減少等癥狀，同時(shí)月經(jīng)量明顯減少，部分出現(xiàn)陰道出血及分泌物增多等副作用。石洪柱等在超聲引導(dǎo)下宮腔注射無(wú)水乙醇治療子宮內(nèi)膜增殖癥，成功率100%，副作用較低，且短時(shí)間內(nèi)均消失[4]。另外，同類治療臨床案例均有多次報(bào)道[5-7,13]，但對(duì)術(shù)后生殖系統(tǒng)、月經(jīng)周期、性激素等的影響均未進(jìn)一步研究。同時(shí)，部分案例報(bào)道中患者要求為無(wú)生育計(jì)劃者，大幅度縮小了無(wú)水乙醇法治療受用者范圍，忽視了無(wú)水乙醇對(duì)患者的生殖系統(tǒng)可能帶來(lái)的影響[4,5]。

雌性小鼠具有規(guī)律的動(dòng)情周期，大約為4～5 d，在此周期內(nèi)，由于受到雌激素、孕激素的影響，小鼠生殖系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生一系列組織學(xué)和生理學(xué)的變化[8,9]。陰道黏膜在雌激素及孕激素的作用下發(fā)生陰道黏膜細(xì)胞增生、角化、脫落的一系列活動(dòng)[8]。在生殖研究類的以雌性小鼠為對(duì)象科研實(shí)驗(yàn)中，規(guī)律的動(dòng)情周期作為生殖系統(tǒng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的重要指標(biāo)之一，常常影響到實(shí)驗(yàn)的發(fā)展及進(jìn)程。無(wú)水乙醇作為使用便捷用且創(chuàng)傷較小的一種治療手段，伴隨著日漸發(fā)達(dá)的超聲引導(dǎo)技術(shù)，越來(lái)越多被應(yīng)用到臨床相關(guān)疾病的靶向治療當(dāng)中。然而，該方法可能會(huì)帶來(lái)的副作用，尤其是不可逆的損傷，必須得到相關(guān)的重視，而不是忽視，或者選擇性回避。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠宮腔注射無(wú)水乙醇，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)各種手段避免無(wú)水乙醇損傷卵巢、輸卵管，保證其單一作用于小鼠子宮，從而進(jìn)一步觀察無(wú)水乙醇損傷子宮對(duì)小鼠動(dòng)情周期的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠的動(dòng)情周期都發(fā)生了不同程度的延長(zhǎng)，其動(dòng)情各期也分別發(fā)生了不同程度的紊亂，猜測(cè)可能由于子宮受到損傷，影響了相關(guān)激素分泌，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行正常的循環(huán)。初步證明無(wú)水乙醇可能對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生了負(fù)面的影響，為臨床使用無(wú)水乙醇提供了一定的選擇思路，但對(duì)于該影響是否可逆，以及深層的紊亂影響機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。

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Effects of intrauterine injection of ethanol on estrous cycle in mice

ZHANG Yin-Hong，WANG Chun-fang，GUO Min，ZHANG Rui-hu，CHEN Zhao-yang*

(Department of Laboratory Animal Science, Shanxi Key Laboratory of Laboratory Animal and Animal Model of Human Diseases，Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)

Objective To investigate the effect of uterine cavity injection of absolute ethanol on estrous cycle in mice.Methods Twenty mice with regular estrous cycle were selected by vaginal exfoliated cells staining, and then were injected absolute ethanol into their uterine cavity. The estrous cycle was observed and recorded every day. Ten mice were selected randomly to observe the changes of second estrous cycle every two hours.Results After the injection of absolute ethanol into the uterine cavity of the experimental mice, the estrous cycle was greatly prolonged, and the various degree of disorder was observed in estrus and pre-estrus. Conclusions The disorder was observed in estrous cycle of mice after the injection of absolute ethanol, which maybe provides some references for clinical use of absolute ethanol.

Ethanol；Intrauterine injection；Estrous cycle

山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源共享服務(wù)平臺(tái)建設(shè)(201605D121019)；山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(2015012001-09)。

張引紅(1972-), 女, 碩士生，實(shí)驗(yàn)師, 研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail:sxndzyh@163.com

陳朝陽(yáng)(1972-), 男,副教授, 研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail: ccytycn@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0051-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.012

2017-01-20