曹蕾 馬揚光 施小明
【摘 要】 介紹了熒光定量PCR儀(ABI7500)操作規(guī)程,總結(jié)了其日常維護和注意事項,為其使用提供指導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】 熒光定量PCR儀 操作規(guī)程 維護
熒光定量PCR儀將PCR熱循環(huán),熒光檢測和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合在一起,可以動態(tài)觀察PCR每一循環(huán)各反應(yīng)管中PCR擴增產(chǎn)物逐漸增加的情況。
1 原理介紹
實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[1]。
熒光染料法:熒光染料能特異性摻人DNA雙鏈,發(fā)出熒光信號,而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步[1]。
熒光探針法:探針的5 端標記熒光報告基團 (reporter R) 3 端標記淬滅基團(quencher Q),探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步[1] [2]。
通常,熒光擴增曲線可分為三個階段,即熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光信號指數(shù)擴增階段,PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,因此可以在該階段進行定量分析。為了便于對所檢測樣本進行比較,在指數(shù)期需要設(shè)定一個熒光信號的閾值。熒光信號由本底進入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)稱為ct值。模板的ct值與其起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,則ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品及其相應(yīng)的ct值可繪制出標準曲線,測得未知樣品的Ct值后,根據(jù)標準曲線便可準確計算出該樣品的起始拷貝數(shù)[3]。
2 操作規(guī)程
2.1 開機
2.1.1 依次打開電腦顯示器和電腦主機的電源開關(guān),進入Windows界面。
2.1.2 接著打開AB7500儀器電源開關(guān),預(yù)熱10分鐘。
2.1.3 點擊SDS軟件。
2.2 檢測
2.2.1 選擇File-New-新建,在New Document Wizard窗口中,從Assay下拉列表中選擇反應(yīng)類型:相對定量,絕對定量,等位基因鑒別或陽性陰性實驗,從Container下拉列表中選擇反應(yīng)板類型,在Default Plate Name中輸入反應(yīng)板文件名,點擊Next,選擇需要添加到反應(yīng)板文件的探針,點擊Next,為每個孔指定探針和任務(wù),單擊Finish。
2.2.2 在Well Inspector-View-Well Inspector中輸入樣品名。
2.2.3 運行相應(yīng)的反應(yīng)類型程序,選擇Instrument設(shè)定PCR條件。
2.2.4 點擊Save下拉菜單下的Save As,輸入文件名,點擊save,關(guān)閉設(shè)置界面。
2.2.5 按壓儀器托盤上的按壓位,待托盤彈出后,將所需檢測反應(yīng)板放入檢測孔位,再次按壓托盤使其滑入儀器,點擊Start開始檢測。
2.3 結(jié)果分析
PCR反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果,對擴增曲線進行分析,選擇Analysis-Analysis Settings 選擇Auto Ct,軟件自動為每個反應(yīng)空生成基線和閾值,也可根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值,Threshold值,點擊Analyze進行再次分析。
2.4 關(guān)機
實驗結(jié)束后取出反應(yīng)管(切勿打開管蓋),順序關(guān)閉AB7500軟件、定量PCR儀電源,關(guān)閉電腦
3 日常清潔維護[4]
3.1 每周用無絨布塊蘸取75%酒精清潔儀器的表面。
3.2 每周使用75%酒精浸泡反應(yīng)管托架(晾干后放回儀器內(nèi))。
3.3 每月執(zhí)行一次背景校準
3.4 每半年檢查燈具狀態(tài)。在7500 Software中,選擇Instrument-Lamp Status/Replacement以確定鹵素?zé)舻臓顟B(tài):Condition顯示 Good 表示燈具工作良好,不需更換鹵素?zé)?;顯示Failed表示鹵素?zé)粢褖模韪鼡Q; Change Soon表示燈具使用超過2000小時,建議將更換。
3.5在PCR儀運行之前或期間,7500 Software可能顯示警告,按警告要求進行目標區(qū)(ROI)校正、背景校準、光學(xué)校準、染料校準、RNase P儀器驗證試驗等。
參考文獻
[1] 鐘江華,張光萍,柳小英.實時熒光定量PCR技術(shù)的研究進展與應(yīng)用[J].氨基酸和生物資源,2011,33(2):68~72.
[2] 蘭靜,李秋根.實時熒光定量PCR技術(shù)理論研究及其在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用[J].南昌大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2011,51(10):97~100.
[3] 王志平.熒光定量PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用[J].渭南師范學(xué)院學(xué)報,2012,27(10):61~64.
[4] 魏建新. ABI7500 型熒光定量PCR儀的使用維護及故障排除[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2015,25(21):3780~3781.