于雷，李永紅，秦璽，楊靖清，饒春明

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

Q-PCR法檢測腺病毒基因治療產品中的復制型腺病毒

于雷，李永紅，秦璽，楊靖清，饒春明

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

目的：建立Q-PCR法檢測腺病毒基因治療產品中的復制型腺病毒（RCA）。方法：首先制備高純度的pXC1質粒參考品（含有E1基因序列），紫外吸收法定量后經過數學換算得到拷貝數；然后比較染料法和探針法的靈敏度，建立適用的Q-PCR檢測方法；最后用新建Q-PCR法定量測定腺病毒基因治療產品中的RCA。結果：pXC1質粒參考品的拷貝數初步標定為2.6×1010拷貝/μL；探針法的靈敏度比染料法高1000倍；將pXC1質粒參考品應用于Q-PCR（探針法）測定腺病毒基因治療產品中的RCA，標準曲線回歸方程為y=-1.416ln（x）+47.395，R2=0.9966，供試品的Cq值均位于標準曲線范圍內。結論：新建Q-PCR法適用于檢測腺病毒基因治療產品中的RCA，且結果準確可靠。

腺病毒基因治療產品；復制型腺病毒；Q-PCR；pXC1質粒

病毒載體類基因治療產品除選擇性復制的 溶瘤體病毒外，都是非復制型的，但是在病毒包裝過程中，病毒基因組可能與包裝細胞基因組經過同源重組產生復制型病毒。出于安全有效、質量可控的考慮，必須對該類病毒進行檢測，以避免其在人體內無控地自我復制，造成傷害，規(guī)避臨床隱患[1-4]。

腺病毒是目前基因治療產品中最常用的病毒載體，其優(yōu)點在于易操作且產量高。作為載體的腺病毒是經過改造的復制缺陷型，其復制必需基因E1區(qū)缺失，不能在除包裝細胞系（293、911、PERC6等）以外的細胞中復制增殖[5-7]。腺病毒類基因治療產品中復制型腺病毒（replication-competent adenoviruses，RCA）的測定主要采用細胞培養(yǎng)法和Q-PCR法[8-14]。細胞培養(yǎng)法是首先將產品感染腺病毒載體毒性耐受的細胞株（如HeLa），用上清在A549細胞中連續(xù)傳代并檢測細胞病變數。該法的缺點是高滴度的腺病毒對細胞有毒性，可能會阻礙RCA的復制，造成假陰性，因此須感染大量細胞，且實驗周期長，需數周時間。Q-PCR法則針對E1區(qū)序列設計引物，繪制標準曲線，對RCA予以定量。但Q-PCR不能絕對定量，需要依賴標準品進行相對定量。本研究擬制備E1模板參考品，建立Q-PCR法定量測定腺病毒基因治療產品中的RCA。我們選擇含有E1基因的pXC1質粒來制備模板標準品，首先制備高純度的pXC1質粒參考品，紫外吸收法定量后經過數學換算得到拷貝數；然后比較染料法和探針法的靈敏度，建立合適的Q-PCR檢測方法；最后將pXC1質粒參考品用于Q-PCR定量測定腺病毒基因治療產品中的RCA。

1 材料與方法

1.1 材料

pXC1質粒購自Biovector公司；高純度質粒DNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；病毒基因組DNA提取試劑盒購自Solarbio公司；Power SYBR Green PCR Master Mix、Luminaris Color Probe qPCR Master Mix購自Thermo Fisher公司；熒光定量PCR儀為Thermo Fisher公司產品。

染料法引物up（5'-GGGTCCGGTTTCTATGCC AA-3'）、down（5'-CCGTATTCCTCCGGTGATAATG-3'），探針法引物1035F（5'-TCCGGTCCTTCTAAC ACACCTC-3'）、1105R（5'-ACGGCAACTGGTTTAA TGGG-3'），探針TGAGATACACCCGGTGGTCCCGC（5-FAM，3-BHQ1）均由六合通公司合成。腺病毒基因治療樣品P53、內皮抑素（endo）、IFN-γ和葡萄糖激酶（GCK）由本科室留存。

1.2 質粒參考品的制備

pXC1質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選單克隆，DNA測序驗證，取生長過夜的菌液，用高純度質粒提取試劑盒提取質粒，紫外吸收法測定濃度。

1.3 染料法

PCR體系（10μL）：上、下游引物（5μmol/L）各1μL，2×Power SYBR Green PCR Master Mix 5μL，模板2μL，去離子水1μL。PCR程序：95℃ 10 min；50個循環(huán)（95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s）。

1.4 探針法

PCR體系（10μL）：上下游引物（5μmol/L）各1μL，探針（1.6μmol/L）1μL，2×Luminaris Color Probe qPCR Master Mix 5μL，模板2μL。PCR程序：50℃ 2 min，95℃ 10 min；50個循環(huán)（95℃ 15 s，60℃ 10 min）。

1.5 病毒基因組DNA的提取

參照試劑盒說明書進行，所有操作在生物安全柜中進行。

2 結果

2.1 pXC1質粒參考品的制備和初步標定

pXC1質粒測序驗證與理論序列完全一致。將提取的pXC1質粒用去離子水稀釋至1/50，測定D260nm、D280nm值，計算DNA濃度，結果見表1。經過換算，得到該pXC1質粒參考品的拷貝數為2.6×1010拷貝/μL。

表1 紫外吸收法測定結果及計算

2.2 染料法和探針法比較

用染料法和探針法對pXC1質粒參考品進行檢測，結果見表2。探針法的最低檢測限為52.0拷貝/μL，而探針法的最低檢測限僅為5.20×104拷貝/μL，前者的靈敏度比后者高1000倍。因此，選用探針法檢測腺病毒基因治療產品中的RCA。

2.3 腺病毒基因治療產品中RCA的測定

用pXC1質粒參考作為標準品繪制標準曲線，對腺病毒基因治療產品進行RCA測定。首先將pXC1質粒分別稀釋至2.6×102、2.6×103、2.6× 104、2.6×105、2.6×106、2.6×107拷貝/μL，將檢測結果繪制標準曲線，得到線性回歸方程y=-1.416ln（x）+47.395，R2=0.9966。圖1A為標準品和供試品的擴增曲線，圖1B為標準曲線。將幾種待測腺病毒基因治療樣品P53、內皮抑素、IFN-γ和葡萄糖激酶測得的Cq值帶入公式，計算樣品中RCA的拷貝數，結果見表3。

表2 染料法和探針法檢測結果

3 討論

Q-PCR法的靈敏度理論上可以達到單拷貝，但是我們實驗中的檢測限僅為52.0拷貝，分析原因可能有以下兩個方面：①質粒的純度，由于質粒提取以后沒有經過進一步的純化，里面可能混雜著大量基因組DNA碎片，使紫外吸收法所測數值偏高，實際拷貝數比計算得到的拷貝數要低；②質粒的空間結構，大部分質粒是緊密折疊的，使模板序列未能充分暴露，PCR不完全。所以，要制備E1DNA標準品，需要純度更高的線性DNA序列。我們目前正在研究使用純化的PCR擴增產物作為模板，即設計引物PCR擴出高特異性的E1基因DNA片段，然后選擇電泳回收或HPLC進行純化，獲得高純度的模板標準品。對模板標準品拷貝數的標定，考慮使用更加準確的液滴式數字PCR替代現(xiàn)有的紫外吸收法。

表3 腺病毒基因治療產品中RCA測定結果

圖1 標準曲線法檢測腺病毒基因治療產品中的RCA

從腺病毒基因治療產品的檢測結果來看，幾種樣品的Cq值均位于標準曲線內，說明該法是適用的，且結果可靠。AD-P53-01和AD-P53-02為同一廠家不同批次的產品，結果相近。AD-GCK-1、AD-GCK-2和AD-GCK-3為同一樣品，ADGCK-1病毒基因組DNA的提取在生物安全柜中進行，而AD-GCK-2和AD-GCK-3在普通實驗室環(huán)境中進行，后者測得結果高出前者數百倍，考慮是被環(huán)境中野生型腺病毒污染，因此該操作必須在生物安全柜中進行，所用試劑和耗材也必須是無腺病毒污染的，以避免假陽性結果出現(xiàn)。

Q-PCR所測定的是E1基因序列，供試品可能由于生產工藝等問題存在殘留的含有E1基因序列的包裝細胞DNA碎片，如果僅依賴Q-PCR方法可能造成假陽性結果。目前有報道使用感染性PCR法來測定復制型腺病毒，該方法將細胞法和Q-PCR法相結合，先將供試品用細胞法培養(yǎng)一段時間使RCA得到擴增，再用Q-PCR法進行檢測，此法在縮短了實驗周期的同時還增加了靈敏度。但是，任何依賴于Q-PCR的方法都需要準確可靠的標準品。因此我們下一步的計劃是以純化的PCR擴增產物DNA片段作為模板，并使用數字定量PCR方法進行標定，建立更加準確可靠的參考品，用于Q-PCR法定量檢測基因治療產品中的RCA。目前美國FDA建議的RCA限量為＜1個RCA/3×1010病毒顆粒，國內相關標準還不完善，需要充分考察相關產品后制定合適的標準。QPCR定量檢測RCA方法的建立，有助于相關標準的確立，對腺病毒基因治療產品的安全性和生產工藝穩(wěn)定性評價具有重要意義。

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Detection of Rep lication-Competent Adenoviruses in Adenoviral Gene Therapy Products by Q-PCR

YU Lei,LI Yong-Hong,QIN Xi,YANG Jing-Qing,RAO Chun-Ming*

National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China

*Corresponding author,E-mail:raocm@nifdc.org.cn

Objective:To develop a Q-PCR method to detect replication-competent adenoviruses（RCA）in adenoviral gene therapy products.Methods:Highly purified pXC1 plasmid（containingE1gene）reference was prepared, the potency was determined by UV method,and the copy number was calculated by mathematical transformation. The sensitivity of SYBR Green method and probe method were compared to determine the appropriate Q-PCR. RCA in adenoviral gene therapy products were detected by newly established Q-PCR method.Results:The copy number of pXC1 plasmid reference was preliminarily calibrated to be 2.6×1010copies perμL;the sensitivity of probe method was 1000 times higher than SYBR Green method.pXC1 plasmid reference was applied to detect RCA in adenoviral gene therapy products by Q-PCR,the regression equation wasy=-1.416ln（x）+47.395,R2= 0.9966,and the Cq values of test samples were located within the scope of standard curve.Conclusion:The developed Q-PCR with high sensitivity is suitable to detect RCA in adenoviral gene therapy products,and its accuracy and reliability are validated.

adenoviral gene therapy products;replication-competent adenoviruses（RCA）;Q-PCR;pXC1 plasmid

Q78

A

1009-0002（2017）03-0352-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.022

2017-04-20

于雷（1984-），女，助理研究員，（E-mail）yulei@nifdc.org.cn；李永紅（1972-），男，研究員，（E-mail）liyh@nifdc.org.cn；并列第一作者

饒春明，（E-mail）raocm@nifdc.org.cn