冉云偉，張改平，劉運(yùn)超，陳玉梅，王聚財(cái)，孟鳳麗，王愛(ài)萍

1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；

2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002

分子伴侶促進(jìn)截短型人乳頭瘤病毒58亞型L1蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)

冉云偉1，張改平2，劉運(yùn)超2，陳玉梅1，王聚財(cái)2，孟鳳麗1，王愛(ài)萍1

1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；

2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002

目的：采用分子伴侶pTf16共表達(dá)的形式促進(jìn)截短型人乳頭瘤病毒（HPV）58亞型L1蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。方法：將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-HPV58-L1轉(zhuǎn)入含有分子伴侶pTf16的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，在2.0 mg/m L L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)20 min之后加入1.0 mmol/L的IPTG，18℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h，使目的蛋白與伴侶蛋白共表達(dá)；重組蛋白經(jīng)GST親和純化后去除GST標(biāo)簽免疫昆明鼠，ELISA檢測(cè)免疫血清效價(jià)。結(jié)果：分子伴侶pTf16能顯著提高目的蛋白的可溶性表達(dá)，經(jīng)純化及去除GST標(biāo)簽，用SDS-PAGE與Western印跡檢測(cè)，約在相對(duì)分子質(zhì)量50×103處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，該條帶與截短型HPV58 L1蛋白預(yù)期大小相符，免疫動(dòng)物后經(jīng)ELISA檢測(cè)小鼠血清的抗體效價(jià)為1∶6400。結(jié)論：獲得了截短型HPV58 L1蛋白，動(dòng)物免疫試驗(yàn)證實(shí)該蛋白具有較好的免疫原性，為進(jìn)一步研制HPV58預(yù)防型疫苗奠定了基礎(chǔ)。

人乳頭瘤病毒58亞型；截短型L1蛋白；伴侶分子pTf16

1933年Shope在綿尾兔（Lepus timidus）體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)兔乳頭瘤病毒（cottontial rabbit papillomavirus，CRPV），隨后相繼在人和許多哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了乳頭瘤病毒[1]。1974年zur Hansen提出生殖上皮非典型增生與宮頸癌的發(fā)生都與人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的感染密切相關(guān)[1]。目前，研究證實(shí)HPV的感染是宮頸上 皮 內(nèi) 瘤 變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌的主要誘導(dǎo)因素[2]。HPV亞型約有200余種，其中能引起生殖道感染的約40種[3]。HPV16和HPV18是全球最常見(jiàn)的感染型別，而HPV58在東南亞地區(qū)宮頸病變中的感染率又很高[4]。研究顯示，我國(guó)上海、香港和臺(tái)灣HPV58在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的檢出率分別為26%、10%、10%，在韓國(guó)和日本分別為16%和8%[5]。

HPV屬于乳頭瘤病毒科（Papillomaviridae）[6]，是一種無(wú)膜包被的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組全長(zhǎng)約8000 bp，其編碼區(qū)可分為早期區(qū)（E區(qū)）和晚期區(qū)（L區(qū)）[7]。病毒主要衣殼蛋白L1為晚期區(qū)編碼蛋白，具有相對(duì)較高的保守性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)效的中和抗體，因此，L1蛋白是研制預(yù)防型疫苗的首選靶標(biāo)[8-9]。目前已上市的疫苗主要是酵母表達(dá)系統(tǒng)或桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的L1蛋白病毒樣顆粒（VLP）疫苗，但這2種表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)復(fù)雜且成本高，不適于在發(fā)展中國(guó)家推廣使用，所以人們一直在嘗試發(fā)展新的廉價(jià)的HPV疫苗。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，一直受到人們的青睞，然而大量研究顯示HPV L1蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)多以包涵體形式存在，僅有少數(shù)有可溶性表達(dá)，但表達(dá)量不高[9]。研究顯示，截短型HPV L1蛋白的表達(dá)量較之全長(zhǎng)型L1蛋白的表達(dá)量高[4]，且一定形式的截短型L1蛋白并不影響其免疫活性[10]。外源蛋白在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)易形成包涵體，而分子伴侶能夠促進(jìn)目的蛋白的可溶性表達(dá)，減少包涵體的形成，提高目的蛋白的活性[11]。因此，我們以HPV58 L1蛋白作為研究對(duì)象，將其N(xiāo)端缺失10個(gè)氨基酸殘基并用GGSGG替代，同時(shí)缺失C端23個(gè)氨基酸殘基，把L1蛋白第403～435區(qū)域缺失突變用GGSGG取代以增加目的蛋白的可溶性，并在N端增加GST-Tag以便于目的蛋白的純化及鑒定。構(gòu)建了包含上述截短型HPV58 L1蛋白編碼基因的原核表達(dá)載體pGEX-6PHPV58-L1，同時(shí)采用與分子伴侶共表達(dá)的方式來(lái)促進(jìn)截短型HPV58 L1蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)，為進(jìn)一步研制HPV58亞型疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

4～6周齡SPF級(jí)雌性昆明小鼠購(gòu)自河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)；截短型HPV58 L1蛋白載體質(zhì)粒pGEX-6P-HPV58-L1及全長(zhǎng)HPV58 L1蛋白表達(dá)菌種pESUMO-HPV58-L1由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；伴侶蛋白質(zhì)粒pTf16購(gòu)自大連寶生物工程有限公司（TaKa-Ra）；感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）購(gòu)自天根生化科技有限公司。

質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；IPTG、HRP標(biāo)記的IgG購(gòu)自華美公司；AEC酶底物試劑盒購(gòu)自中山金橋公司；氨芐西林（Amp）、氯霉素（Cm）購(gòu)自哈藥集團(tuán)；3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購(gòu)自Sigma公司；GST柱子購(gòu)自GE公司。

1.2 分子伴侶共表達(dá)菌株的構(gòu)建

將伴侶蛋白質(zhì)粒pTf16轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，并制備感受態(tài)細(xì)胞，隨后將1μL陽(yáng)性質(zhì)粒pGEX-6P-HPV58-L1加入100μL制備好的含分子伴侶的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴中靜止30 min，42℃水浴中靜止60～90 s，輕輕取出放入冰中靜置2 min，向其中加入500μL LB培養(yǎng)液，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，4℃、4000 r/ min離心4 min，棄去部分上清，留下100μL將菌體重懸后用無(wú)菌彎頭玻璃棒涂布于A(yíng)mp+/Cm+的固體培養(yǎng)基，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜，挑選6個(gè)單克隆于A(yíng)mp+/Cm+雙抗液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，保存菌種，提取質(zhì)粒，進(jìn)行核酸電泳鑒定。

1.3 伴侶分子pTf16與目的蛋白的共表達(dá)

分別將含有分子伴侶與不含分子伴侶的菌體按1∶1000接種于A(yíng)mp+/Cm+或Amp+LB培養(yǎng)液中，37℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)活化，將活化菌體按1∶100接種于新鮮的相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃、220 r/min培養(yǎng)2 h，待D600nm達(dá)0.6左右，分別對(duì)伴侶分子和HPV58 L1蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。首先，加入終濃度為2 mg/mL的誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖，37℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)20 min；之后加入終濃度為1.0 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，18℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；不含分子伴侶的重組表達(dá)菌只加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；將誘導(dǎo)后的樣品分別進(jìn)行超聲波破碎（30%的全功率，超聲3 s，暫停5 s，工作時(shí)間為10 min），12 000 r/ min離心15 min，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.4 共表達(dá)條件的優(yōu)化

分別對(duì)IPTG濃度、L-阿拉伯糖濃度及L-阿拉伯糖誘導(dǎo)時(shí)間等共表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。將過(guò)夜活化的共表達(dá)菌液1∶100接種到Amp+/Cm+LB培養(yǎng)液中，37℃、220 r/min培養(yǎng)2 h，待D600nm達(dá)0.6左右，加入終濃度為2 mg/mL的L-阿拉伯糖，37℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)20 min；再分別加入終濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，18℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，分析不同濃度IPTG對(duì)目的蛋白表達(dá)情況的影響；待經(jīng)活化的菌液D600nm達(dá)0.6左右，加入終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、2、3 mg/mL的L-阿拉伯糖，37℃、220 r/min培養(yǎng)20 min；加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，18℃、220 r/min振蕩培養(yǎng) 24 h，分析不同濃度L-阿拉伯糖對(duì)目的蛋白表達(dá)情況的影響；待經(jīng)活化的菌液D600nm達(dá)0.6左右，加入終濃度為2 mg/mL的L-阿拉伯糖，37℃、220 r/min分別培養(yǎng)0、5、10、15、20、25、30 min；加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，18℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，分析加入L-阿拉伯糖不同時(shí)間后再加入IPTG對(duì)目的蛋白表達(dá)情況的影響；最后將誘導(dǎo)后的樣品分別進(jìn)行超聲波破碎（30%的全功率，超聲3 s，暫停5 s，工作時(shí)間為10 min），12 000 r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 目的蛋白的純化

收集經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌體，重懸后超聲波破碎，12 000 r/min離心15 min，收集上清，經(jīng)GST親和層析柱純化，收集洗脫液，進(jìn)行12%的SDS-PAGE分析，將洗脫液于4℃透析，測(cè)定蛋白含量，用Prescission Protease酶切，酶切后的蛋白再經(jīng)GST親和層析柱純化去除GST標(biāo)簽，收集上樣后的流出液，分別進(jìn)行12%的SDS-PAGE及Western印跡鑒定。

1.6 重組蛋白HPV58 L1的免疫評(píng)價(jià)

1.6.1 免疫昆明鼠 取純化獲得的HPV58 L1蛋白，按200μL/只經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射免疫昆明小鼠。分為3組，第1組免疫劑量為40μg，第2組免疫劑量為20μg，第3組為PBS對(duì)照組；共免疫3次，免疫間隔3周，首免等比例加入弗氏完全佐劑，后2次免疫等比例加入弗氏不完全佐劑。免疫后0、21、28、35 d斷尾采血；三免后2周，將小鼠摘眼球取血，3000 r/min離心5 min收集血清，測(cè)定效價(jià)。

1.6.2 ELISA測(cè)定抗體效價(jià) 用碳酸鹽緩沖液將純化的帶有SUMO標(biāo)簽的HPV58 L1蛋白稀釋至2μg/mL，按50μL/孔加入96孔ELISA板內(nèi)，4℃包被過(guò)夜；PBST（PBS+0.5%吐溫-20）洗5次，每孔加入200μL 5%的脫脂奶，37℃封閉2 h；PBST洗3次，第一孔按1∶200加入100μL待檢血清，第2～12孔分別加入50μL PBS，取出第1孔50 μL血清加入第2孔充分混勻，按1/2梯度稀釋至第11孔，棄去50μL，37℃孵育1 h，PBST洗5次；每孔加入 50μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（1: 5000），37℃孵育30 min，PBST洗5次；加入顯色液，室溫條件下顯色8 min，之后加入2 mol/L硫酸終止顯色，測(cè)定D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 分子伴侶與目的基因共表達(dá)載體的構(gòu)建

提取共表達(dá)菌質(zhì)粒電泳鑒定，結(jié)果顯示2、4、5號(hào)既含有目的蛋白質(zhì)粒也含有伴侶蛋白質(zhì)粒，說(shuō)明共表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖1）。

2.2 分子伴侶與目的基因共表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

分別將含或不含分子伴侶的重組表達(dá)菌體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示含有分子伴侶的菌體超聲波上清明顯可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為72×103的目的條帶和55×103的伴侶蛋白條帶，大小與預(yù)期一致，而沉淀中幾乎無(wú)目的蛋白；而不含分子伴侶的菌體超聲波上清中幾乎無(wú)目的蛋白，沉淀中明顯可見(jiàn)72×103的目的條帶（圖2）。說(shuō)明分子伴侶能顯著提高目的蛋白的可溶性表達(dá)，有效減少了包涵體的形成。

2.3 共表達(dá)條件的優(yōu)化

圖1 共表達(dá)菌質(zhì)粒的電泳鑒定

圖2 分子伴侶與目的基因共表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定

分別對(duì)IPTG濃度、L-阿拉伯糖濃度及L-阿拉伯糖誘導(dǎo)時(shí)間等共表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，隨著IPTG濃度的提高，目的蛋白可溶性表達(dá)量有一定升高，故選擇1.0 mmol/L為IPTG最終誘導(dǎo)濃度（圖3A）；而伴侶蛋白誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖濃度（圖3B）及加入時(shí)間（圖3C）對(duì)目的蛋白的影響不大，從SDS-PAGE結(jié)果可以看出在2.0 mg/mL的L-阿拉伯糖條件下目的蛋白可溶性表達(dá)量相對(duì)較高。故選擇37℃、220 r/min、2.0 mg/mL的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)20 min后，加入終濃度為1.0 mmol/ L的誘導(dǎo)劑IPTG，18℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為最適誘導(dǎo)表達(dá)條件。

2.4 目的蛋白的純化及GST標(biāo)簽的切除

純化后的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE與Western印跡分析，結(jié)果顯示Prescission Protease可以有效切除GST標(biāo)簽。經(jīng)純化后去除GST標(biāo)簽，截短型HPV58 L1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約50×103，與預(yù)期重組蛋白大小相符，純度可達(dá)90%以上（圖4）。

2.5 血清抗體效價(jià)的測(cè)定

圖3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

ELISA結(jié)果顯示，不同小鼠個(gè)體間免疫應(yīng)答水平存在一定差異，40μg免疫劑量組小鼠血清抗體效價(jià)基本上都能達(dá)到1∶6400，20μg免疫劑量組小鼠血清抗體效價(jià)為1∶1000～1∶3200，而PBS對(duì)照組均無(wú)特異性抗體產(chǎn)生（圖5A）。經(jīng)Graph-Pad Prism 5軟件分析，與PBS對(duì)照組相比，40μg或20μg免疫劑量組均具有顯著性差異，40μg與20μg免疫劑量組之間差異不顯著（圖5B）。

3 討論

圖4 酶切前后目的蛋白的SDS-PAGE（A）及Western印跡（B）

圖5 ELISA測(cè)定免疫血清效價(jià)

HPV主要衣殼蛋白L1能形成五聚體的子粒，HPV衣殼由72個(gè)子粒構(gòu)成[12]。目前上市的預(yù)防性疫苗主要是針對(duì)L1蛋白的VLP疫苗[13]，HPV L1蛋白作為疫苗已被實(shí)踐所證實(shí)。目前的L1蛋白疫苗主要來(lái)自酵母表達(dá)系統(tǒng)或桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，也有大量研究集中在原核表達(dá)系統(tǒng)，但大腸桿菌中表達(dá)的L1蛋白多以包涵體形式存在，可溶性表達(dá)量不高。已有研究表明截短型HPV L1蛋白表達(dá)量高于未截短的L1蛋白表達(dá)量[14-15]，且如N端10個(gè)氨基酸的缺失或C端部分氨基酸的缺失等的截短型HPV L1蛋白仍能保持其生物學(xué)活性[10,16]。另外，Xu等的最新研究顯示HPV58 L1蛋白N端1～35位及C端403～435位氨基酸并不包含潛在的B細(xì)胞表位，C端也不包含關(guān)鍵的抗原表位[17]。我們將HPV58 L1蛋白N端10個(gè)氨基酸、403～435區(qū)域及C端23個(gè)氨基酸進(jìn)行缺失，研究截短型HPV58 L1蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及其免疫原性。為了提高蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)內(nèi)的可溶性表達(dá)，常用方法有降低誘導(dǎo)表達(dá)溫度、加入分子伴侶或融合蛋白與目的蛋白共表達(dá)[18]、加入化學(xué)物質(zhì)山梨醇[19]等。本實(shí)驗(yàn)采用分子伴侶pTf16與目的蛋白共表達(dá)的方法，分析伴侶蛋白pTf16對(duì)目的蛋白可溶性表達(dá)的影響，結(jié)果表明pTf16能顯著提高帶有GST標(biāo)簽的截短型HPV58 L1蛋白的可溶性表達(dá)，有效減少包涵體的形成。經(jīng)酶切純化除去GST標(biāo)簽后，獲得較高純度的截短型HPV58 L1蛋白，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)無(wú)論40μg還是20μg的免疫劑量，與PBS陰性對(duì)照組相比，血清抗體效價(jià)均呈顯著性差異，表明該截短型HPV58 L1蛋白具有良好的免疫原性。

綜上所述，本研究以帶有GST標(biāo)簽的目的蛋白與分子伴侶共表達(dá)的形式，顯著提高了目的蛋白的可溶性表達(dá)量；經(jīng)過(guò)純化、GST標(biāo)簽去除，最終獲得純度達(dá)90%的目的蛋白，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)該截短型HPV58 L1蛋白具有較高的免疫原性，為后期HPV疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

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Recombinant Expression of Truncated Human Papillom avirus 58 L1 Protein with Molecular Chaperones in E.coli

RAN Yun-Wei1,ZHANG Gai-Ping2,LIU Yun-Chao2, CHEN Yu-Mei1,WANG Ju-Cai2,MENG Feng-Li1,WANG Ai-Ping1*

1.School of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001;
2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002;China

*Corresponding authors,E-mail:pingaw@126.com

Objective:To improve the soluble expression efficiency of truncated human papillomavirus（HPV）type 58 L1 protein inE.colithrough the co-expression with molecular chaperone pTf16.Methods:The recombinant expression plasmid,pGEX-6P-HPV58-L1,was transferred into the competence ofE.coliBL21 containing pTf16,to construct prokaryotic co-expression vector.The best inducing conditions of recombinant protein were,at 18℃ for 24 h with 2.0 mg/mL L-arabinose and 1.0 mmol/L IPTG.The recombinant protein GST-HPV58-L1 was obtained and purified with GST affinity column using one-step protocol.After cleavage of GST-Tag,the truncated HPV58 L1 proteins were used to immunize Kunming-mice to acquire antiserum,and antiserum was analysed by ELISA.Results:Molecular chaperone pTf16 can significantly improve the soluble expression efficiency of truncat-ed HPV58 L1 protein inE.coli.The truncated HPV58 L1 protein was identified by SDS-PAGE and Western blot and showed a specific band at about 50 kD.The results of ELISA showed that the antiserum had the high titer（1∶6400）.Conclusion:The truncated HPV58 L1 was successfully obtained and with high immunogenicity,which laid the foundation for further development of HPV58 preventive vaccine.

human papillomavirus（HPV）type 58;truncated L1 protein;molecular chaperone pTf16

Q78

A

1009-0002（2017）03-0295-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.011

2016-12-06

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)和創(chuàng)新人才支持計(jì)劃（14HASTIT027）

冉云偉（1990-），男，碩士研究生，（E-mail）1375530798@qq.com

王愛(ài)萍，（E-mail）pingaw@126.com