程智超，欒雨陽，康浩洋，王文浩，吳昊旻

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150000）

水是生命之源，20 世紀70 年代以來，人口迅速增加，城市化工業(yè)化發(fā)展日益加快，水資源短缺已經(jīng)威脅到了糧食生產(chǎn)，隨意排放養(yǎng)殖廢水一方面增加水污染，另一方面損害周邊居民的生活與健康，在這項研究中，我們調(diào)查了土壤細菌群落的組成與豬場養(yǎng)殖廢水的關(guān)系。研究地點位于中國東北的三江平原，試驗地種植水稻，用已處理的養(yǎng)殖廢水與未處理的養(yǎng)殖廢水和清水進行澆灌。細菌特異性16S rRNA 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的高通量測序用于鑒定細菌分類群。在所有三種樣品類型中，細菌多樣性在已處理的未處理的養(yǎng)殖廢水用中最高，在清水中較低，經(jīng)過處理的養(yǎng)殖廢水最低。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了有效管理土壤細菌群落以維持自然功能土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要性，提出適宜的養(yǎng)殖廢水灌溉方法.。

養(yǎng)殖廢水被我國充分發(fā)揮其“水肥效應(yīng)”優(yōu)勢，深刻感受到養(yǎng)殖廢水對我國的重要影響，取得了非常大的利益。但是，養(yǎng)殖廢水規(guī)模的進一步擴大，環(huán)境也隨之出現(xiàn)了問題，土壤由于鈉害的退化;有毒元素對作物的毒害與污染等。由此可見，養(yǎng)殖廢水灌溉對農(nóng)作物生長、以及對農(nóng)田環(huán)境的污染等方面都存在著諸多的不定因素。

基于高通量DNA 測序技術(shù)，在此評估土壤細菌群落的多樣性，實驗研究對揭示養(yǎng)殖廢水灌溉土壤環(huán)境的影響有重要幫助。該研究有助于改善土壤生態(tài)系統(tǒng)，對農(nóng)民保護和利用農(nóng)田提供明確指導(dǎo)。

1 場地描述與土壤采樣

該研究在黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所三江濕地實驗站（北緯47°35'，東經(jīng)133°31'）進行。當?shù)卦缕骄鶜鉁卦?月為-21.6 ℃至7月為21.5 ℃，年平均氣溫為1.9 ℃。海拔55～65 m，年平均降水量為550～610 mm，其中約80%發(fā)生在5～10月。

根據(jù)試驗地的土層厚度特征，利用用剖面取樣法，于2018 年10 月15 日在0～20 cm 的深度采集土壤樣本，每塊地選取有代表性的5個點取土樣。在每個地點取樣約1 500 g 。把每份新鮮的土樣用連個袋子裝，一個袋子的新鮮土樣用來自然風(fēng)干，風(fēng)干后，磨成粉，檢查密封性后,裝好放于4C冷卻，立即送回實驗室，并及時進行試驗檢測。

2 土壤微生物DNA的提取

利用FastDNA0 SpinKitforSoil試劑盒MPBiomedicals提取0.5 g 三組土壤細菌基因組總DNA，將每組提取得到的土壤DNA 溶解在70 μL 無菌TE 緩沖液40 mmol·L-1TrisHCl，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0）詳細按說明書進行操作。

高通量測序：細菌基因組總DNA 送到上海Majorbio 生物技術(shù)有限公司進行Miseq高通量測序。細菌16srDNA擴增引物采用通用引物（8F/533R）。

3 基因優(yōu)化

可以正向或反向地影響到基因的表達，內(nèi)含子供體和接入位點的共同識別序列分別是CAG，GUA。在前一個接入位點上的外顯子下游也有一個富含GAG 的區(qū)域。外顯子中剪接增強子的存在能極大地促進內(nèi)含子的切除和成熟mRNA 向細胞質(zhì)的外送。在載體設(shè)計中,在eDN&前至少加入1個內(nèi)含子會促進cDNA 的表達。而為了切除內(nèi)含子，則需要在第一個和最后一個外顯子中包含剪接增強子序列有助于精確控制外源基因編碼序列的高表達。

OTU 群落聚類及相關(guān)分析：按每個小組為一個OUT 的原則，通過歸類操作，將序列按照DNA 相似性分為許多個小組。通常按97%（0.03）的有序列進行OTU 劃分并進行生物信息統(tǒng)計分析。

構(gòu)建稀疏曲線：利用已測得16S rDNA 序列中已知的各種OTU 的相對比例，來計算抽取n個（n小于測得reads 序列總數(shù)）reads時出現(xiàn)OTU數(shù)量的期望值。

PCoA 分析：通過一系列的特征值進行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值，利用PCoA 可以找到距離矩陣中最主要的坐標，并且不改變樣品點之間的相互位置關(guān)系，只改變了坐標系統(tǒng)。通過PCoA 分析可以用來觀察每個個體與群落之間的關(guān)系。

4 小 結(jié)

從3 種灌溉用水對土壤微生物細菌群落的影響來看，對農(nóng)田的耕種及利用方式具有重要作用。土壤微生物細菌多樣性可以表示上壤生態(tài)系統(tǒng)的變化。用未處理養(yǎng)殖廢水灌溉與用清水灌溉和已處理養(yǎng)殖廢水灌溉相比較，用未處理養(yǎng)殖發(fā)水灌溉后，土壤微生物群落得到一定改善，土壤養(yǎng)分升高，改善了土壤微生物學(xué)性質(zhì)。本研究意在通過灌溉養(yǎng)豬養(yǎng)殖廢水種植農(nóng)作物，測試土壤微生物細菌群落的組成，探討該養(yǎng)殖廢水用于農(nóng)作物裁培的可能性,為養(yǎng)殖廢水灌溉方法提供適宜的方法。