張璐璐+李靜+吳翼+許麗菁+楊耀東

摘 要 分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。簡(jiǎn)要介紹幾種常用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)的原理及應(yīng)用，主要綜述分子技術(shù)在椰子種質(zhì)資源研究的進(jìn)展，介紹在椰子遺傳多樣性和遺傳關(guān)系分析方面的研究狀況，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞 椰子 ；分子標(biāo)記 ；種質(zhì)資源

中圖分類號(hào) S565.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.05.008

Research and Application of Coconut Molecular Markers

ZHANG Lulu1，2） LI Jing2） WU Yi2） XU Lijing2） YANG Yaodong2）

（1 Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070；

2 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/

Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339）

Abstract Molecular markers are widely used in various fields of scientific research. The principle and application of some DNA molecular marker techniques were introduced and the research advances in application of molecular techniques in coconut germplasm were reviewed. The research status of coconut genetic diversity and genetic relationship analysis was discussed， and the application prospects of molecular markers were put forward.

Keywords coconut ； molecular marker ； germplasm resources

椰子（Cocos nucifera L.）是棕櫚科椰子屬中唯一的一個(gè)種，為單子葉多年生常綠喬木，經(jīng)濟(jì)壽命40～80 a，自然壽命可達(dá)100 a以上。椰子在長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇中逐漸形成了三種類型，高種椰子、矮種椰子以及介于高種和矮種之間的中間類型。矮種椰子較高種椰子營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的時(shí)間短，也需4～6年才能開花結(jié)果。椰子較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期給椰子的遺傳育種造成很大困難。目前，我國(guó)椰子育種手段落后，育種方法比較單一，依靠常規(guī)育種的方法不但耗時(shí)耗力，而且表型性狀受基因型和復(fù)雜環(huán)境條件影響，給人工選擇造成許多不確定因素，并且育種周期長(zhǎng)、品種更新?lián)Q代慢、優(yōu)良品種少，遠(yuǎn)不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要[1]。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于椰子種質(zhì)資源的研究，分子標(biāo)記技術(shù)提高了遺傳分析的準(zhǔn)確性和選育種的有效性，在遺傳育種領(lǐng)域越來(lái)越受重視。隨著分子標(biāo)記研究的深入，目前在遺傳多樣性檢測(cè)、品種鑒定、重要性狀的定位、遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳關(guān)系的鑒定及分子標(biāo)記輔助育種等方面都有一定的研究[2]。本文對(duì)幾個(gè)分子標(biāo)記技術(shù)以及幾個(gè)分子標(biāo)記研究領(lǐng)域的應(yīng)用作簡(jiǎn)要概述。

1 常見的幾種分子標(biāo)記

1.1 RFLP

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）即DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。該技術(shù)是根據(jù)酶切位點(diǎn)之間堿基的插入、缺失導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生變化，這種變化通過(guò)電泳分離、經(jīng)Southern印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，經(jīng)放射自顯影即可顯示多態(tài)性圖譜[3]。 RFLP為共顯性標(biāo)記，不受顯隱關(guān)系和環(huán)境條件影響，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可應(yīng)用于品種鑒定、親緣關(guān)系分析、預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)、基因定位、分子輔助遺傳育種等。但因靈敏度不高、操作繁瑣、步驟繁雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高等原因限制了RFLP技術(shù)的應(yīng)用[4]。

1.2 RAPD

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，是以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)性核苷酸序列為引物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳和放射自顯影來(lái)檢測(cè)[5]。該技術(shù)在設(shè)計(jì)引物時(shí)不需知道引物序列信息、操作簡(jiǎn)單快捷、通用性強(qiáng)、靈敏度高、操作安全，但此技術(shù)易受外界影響、穩(wěn)定性及重復(fù)性較差、易產(chǎn)生假帶，且為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分雜合體和純合體。RAPD可對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物種系品種鑒定、遺傳多樣性分析、連鎖圖的構(gòu)建等。

1.3 AFLP

AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphic）即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，是RFLP和RAPD技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記銀染、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，根據(jù)凝膠上的DNA指紋檢測(cè)多態(tài)性。該技術(shù)既有RFLP技術(shù)的可靠性，又有RAPD技術(shù)的高效性，能穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)基因組DNA的差異，不需預(yù)先知道DNA序列[6]。AFLP主要應(yīng)用于種質(zhì)資源的鑒定和保存、基因表達(dá)和調(diào)控研究、輔助選擇育種、指紋圖譜的分析構(gòu)建和目標(biāo)性狀基因連鎖圖構(gòu)建等。

1.4 SSR

SSR（Simple Sequence Repeat）即簡(jiǎn)單重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星（microsatellite），是含少數(shù)幾個(gè)堿基對(duì)的短串聯(lián)重復(fù)序列，隨機(jī)廣泛分布于真核生物基因組中，不同的遺傳材料由于重復(fù)次數(shù)的不同而產(chǎn)生多態(tài)性。SSR具有標(biāo)記數(shù)量多、DNA用量少、操作簡(jiǎn)便、多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確高效的鑒別大量的等位基因，但必須對(duì)其兩端序列測(cè)序才能設(shè)計(jì)出相應(yīng)的引物，引物具有高度的種屬特異性，開發(fā)成本較高[7]。已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性研究、品種鑒定、基因定位、指紋圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助選擇育種等多個(gè)方面。

2 分子標(biāo)記在椰子研究中的應(yīng)用

2.1 種質(zhì)資源遺傳關(guān)系分析

分子標(biāo)記是檢測(cè)種質(zhì)資源遺傳多樣性的有效工具，分子水平的數(shù)據(jù)可以反映物種的系統(tǒng)演化、物種與品種的親緣關(guān)系和分類，比傳統(tǒng)的方法更能反映物種間的遺傳多樣性。

Sankaran和Damodaran等[8]利用RAPD標(biāo)記法從45個(gè)隨機(jī)引物中選取13個(gè)表達(dá)引物，對(duì)30個(gè)椰子品種進(jìn)行遺傳分析，獲得的多態(tài)性基因型與選定的多態(tài)RAPD標(biāo)記顯示不同的變異為67.33%，13個(gè)引物的平均多態(tài)信息含量（PIC）值是0.29，最大和最小值是0.46和0.17，引物分別是OPF-19和OPH-25，RAPD分析得到的結(jié)果和早期研究結(jié)果一致。用UPGMA聚類分析法將這些椰子進(jìn)行聚類分析得到2個(gè)集群，第一個(gè)集群包含一個(gè)矮種WCGC 08，第二個(gè)集群包含其余29個(gè)椰子品種，結(jié)果表明，集群模式?jīng)]有任何地理的親和力。

Baudouin等[9]利用30個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)11個(gè)地區(qū)的椰子進(jìn)行基因型分析，這些椰子來(lái)源于1 215個(gè)椰子中的104個(gè)巴拿馬高種，選擇沒有被遺傳污染的54個(gè)椰子，還有其中的80個(gè)高種椰子共來(lái)自11個(gè)地區(qū)，通過(guò)得到的微衛(wèi)星位點(diǎn)，用Geneclass 2軟件分析得到相似指數(shù)，菲律賓與巴拿馬椰子相似系數(shù)最高，與波利尼西亞相似系數(shù)最小，比較分析波利尼西亞和菲律賓30個(gè)位點(diǎn)的相似系數(shù)，三分之一的位點(diǎn)相對(duì)于巴拿馬高種菲律賓有較高的基因頻率，波利尼西亞缺失或罕見。對(duì)于其它地區(qū)，墨西哥的相似系數(shù)接近菲律賓，基于遺傳相似性墨西哥起源將會(huì)是一個(gè)合理的替代，但歷史因素表明，墨西哥椰子和巴拿馬椰子之間的遺傳關(guān)系源于他們的共同祖先菲律賓椰子。

肖勇和羅意等開發(fā)了來(lái)自Illumina公司轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)的30個(gè)新的微衛(wèi)星標(biāo)記，并應(yīng)用這些標(biāo)記的遺傳多樣性評(píng)估了12個(gè)來(lái)自中國(guó)和18個(gè)來(lái)自東南亞的椰子品種。微衛(wèi)星標(biāo)記在群體中顯示由低到高的遺傳多態(tài)性，觀察到的雜合性變化從0.06到0.79 ，平均為0.39±0.15。研究結(jié)果表明，東南亞群體的等位基因數(shù)量顯著增加（p= 0.02），但相比來(lái)自中國(guó)的品種觀察到的雜合性（p =0.08）或香農(nóng)多樣性指數(shù)評(píng)分（p=0.12）差異性不明顯（p<0.05）。種群結(jié)構(gòu)分析表明，中國(guó)椰子與東南亞椰子種質(zhì)資源的一個(gè)子群類似，這表明中國(guó)椰子沒有獨(dú)立發(fā)展的東南亞種群。結(jié)合種群結(jié)構(gòu)分析和歷史信息，設(shè)計(jì)了一個(gè)可能的解釋為從東南亞到中國(guó)椰子的傳播模式：海洋洋流可能攜帶椰子到海南，而云南省椰子可能是來(lái)自東南亞人類傳播[10]。

Manimekalai等[11]利用19個(gè)引物產(chǎn)生的199個(gè)ISSR標(biāo)記對(duì)從全球椰子在國(guó)際資源庫(kù)收藏的29個(gè)高種、2個(gè)中間型、2個(gè)矮種共 33個(gè)椰子進(jìn)行分析，其中154個(gè)標(biāo)記具有多態(tài)性（77%）。33個(gè)椰子的199個(gè)ISSR標(biāo)記相似系數(shù)范圍是0.526到0.855，平均為0.674。33個(gè)椰子品種可以形成528對(duì)組合，尼日利亞高（NIT）和巴拿馬高（PNT）相似性指數(shù)最高（0.855），而chowghat橙色矮種（COD）和尼科巴高（NICT01）相似性指數(shù)最低（0.526）。在東南亞平均一對(duì)相似性指數(shù)達(dá)到0.737，南太平洋南亞和大西洋分別0.687和0.638。系統(tǒng)樹圖顯示聚集為六個(gè)集群，大部分高種集中在3個(gè)集群。系統(tǒng)樹圖和主坐標(biāo)圖顯示，東南亞椰、南亞椰和南太平洋椰形成獨(dú)立的分組，這些分組和通常椰子從其起源的中心的傳播模式一致。

2.2 分子標(biāo)記輔助育種

分子標(biāo)記輔助育種即通過(guò)對(duì)椰子重要性狀的分子標(biāo)記的研究，篩選出與性狀緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，對(duì)目標(biāo)基因?qū)嵤╅g接選擇，在早代進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，可提高選擇的準(zhǔn)確性和育種效率。

人工授粉是使用國(guó)際椰子資源庫(kù)的老化椰子再生，這個(gè)過(guò)程的有效性尚未評(píng)估。Saraka等[12]使用15個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)三個(gè)高種椰子，莫桑比克高種（MZT）、加澤爾半島高種（GPT）和塔希提島高種（THT） 再生（G1）和父母（G0）之間的相似之處進(jìn)行分析。15個(gè)SSR引物產(chǎn)生123個(gè)等位基因，平均基因多態(tài)性為0.734，在再生的基因多樣性相對(duì)減少，它從0.690下降到0.587，但是發(fā)現(xiàn)高種椰子再生和父母之間Jaccard相異指數(shù)較低，從0.072到0.133不等。記錄下來(lái)G0-G1高種椰子的遺傳多樣性值較低（DST），從0.005到0.007，世代和高種椰子之間的平均基因岐異值為0.11，范圍是0.072～0.133。因此，對(duì)基因庫(kù)使用控制授粉技術(shù)的再生方法可有效滿足保護(hù)登記入冊(cè)的原始椰子的遺傳完整性。

Yaima等[13]對(duì)科特迪瓦大烏拉地區(qū)出現(xiàn)的椰子樹致死性黃化病癥狀和感染植原體進(jìn)一步測(cè)試植原體病原體16srRNA基因的特征分析。測(cè)試17個(gè)椰子中7個(gè)有癥狀的嵌套PCR植原體普遍存在致死性黃化病，特異性引物擴(kuò)增影響產(chǎn)品的預(yù)期大小，而未受感染的無(wú)癥狀的植物無(wú)任何DNA擴(kuò)增。檢測(cè)到大烏拉椰子樹（KC999037）感染的科特迪瓦致死性黃化病植原的16srDNA序列與加納16SrXXII群組的致死性黃化病植原體有99%的序列有一致性。16srDNA的虛擬和實(shí)際基礎(chǔ)序列RFLP和系統(tǒng)發(fā)育分析表明在大烏拉的植原體與科特迪瓦致死性黃化病被命名為16SrXXII-B，是組群16SrXXII的新子群。目前的結(jié)果支持先前疾病是從鄰國(guó)加納傳播到科特迪瓦的懷疑，可能對(duì)大烏拉地區(qū)的椰子樹的生存和象牙海岸的椰子產(chǎn)業(yè)構(gòu)成威脅。

2.3 遺傳多樣性分析

不同的DNA標(biāo)記系統(tǒng)已經(jīng)用于評(píng)估椰子的遺傳多樣性，分子標(biāo)記產(chǎn)物的多態(tài)性可以反映測(cè)試材料的多樣性，為種質(zhì)資源的研究提供了方便。

Rajesh等[14]利用一個(gè)簡(jiǎn)單新穎的標(biāo)記系統(tǒng)以其密碼子多態(tài)性（SCoT）來(lái)評(píng)估椰子，作為一個(gè)潛在的標(biāo)記系統(tǒng)。用SCoT標(biāo)記評(píng)估23個(gè)代表不同的地理區(qū)域的椰子（10個(gè)高種和13個(gè)矮種）的遺傳多樣性。從25個(gè)SCoT引物中篩選了15個(gè)引物進(jìn)行下一步研究，得到102 個(gè)記錄片段，其中87.2%具有多態(tài)性，用軟件NTSYS-pc2.0分析數(shù)據(jù)，相似系數(shù)值介于0.37（CCNT和KTOD）和0.91（MYD和MOD）之間。用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)樹圖，得到2個(gè)集群，高種和矮種椰子的劃分很明顯，一般來(lái)說(shuō)，椰子在同一地理區(qū)域的聚集在一起。根據(jù)SCoT觀察分析椰子遺傳多樣性與早些時(shí)候使用其它標(biāo)記系統(tǒng)的結(jié)果相差無(wú)幾。

Margarita等[15]利用Meerow等[16]先前研究的15個(gè) SSR標(biāo)記分析8個(gè)椰子品種得到的大西洋高種和巴拿馬高種兩個(gè)高種的異型雜交，增加馬來(lái)矮種和巴拿馬高種的雜交種和一種未知椰子，利用28個(gè)分子標(biāo)記和之前的15個(gè)分子標(biāo)記分析對(duì)由218個(gè)基因型組成的10個(gè)椰子品種進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明，每個(gè)位點(diǎn)上等位基因數(shù)范圍從2～14，而平均基因多樣性從0.035到0.546不等。多態(tài)信息含量（PIC）值的范圍從0.091到0.838，平均為0.531，在每個(gè)品種的基礎(chǔ)上平均等位基因豐富度范圍從1.01到1.90。用2種聚類方法NJ 和UPGMA生成系統(tǒng)樹圖，結(jié)果有一致的分組也有顯著的差異，使用2種聚類分析方法解決品種的對(duì)比關(guān)系，研究結(jié)果影響當(dāng)前椰子馴化和未來(lái)評(píng)估不同品種之間的遺傳關(guān)系。

Lebrun[17]通過(guò)對(duì)倫內(nèi)爾島的一個(gè)隔離后代的高種進(jìn)行重量和比率QTL分析，得到了控制椰子果實(shí)組分的遺傳因素。這個(gè)群體在先前Lebrun[17]等的研究中已經(jīng)建立基礎(chǔ)連鎖圖，以及對(duì)QTL分析的果實(shí)產(chǎn)量。新添加的53個(gè)的標(biāo)記（主要是SSRs）完善了連鎖圖。11個(gè)性狀研究共鑒定了52個(gè)QTLs，它們中的34個(gè)分別聚集在6個(gè)集群，這可能符合單基因多效性。一些添加的QTLs位點(diǎn)除了聚集在這些集群，也對(duì)個(gè)體性狀有相對(duì)較大的影響。連鎖圖譜總共有290個(gè)隔離標(biāo)記（80個(gè)SSR， 8個(gè)E. guineensis標(biāo)記，6個(gè)RFLP和204個(gè)AFLP標(biāo)記）。如上所述，由作圖群體的RIT親本建立連鎖圖16個(gè)連鎖群。連鎖圖的總長(zhǎng)度是1849.8 cM，連鎖圖長(zhǎng)度從51.9 cM到181.8 cM不等?？偣灿?74個(gè)標(biāo)記位于更新連鎖圖上（比先前Lebrun的2001年連鎖圖多47個(gè)）。每個(gè)連鎖群標(biāo)記的數(shù)量在6～28，連鎖群之間的平均密度3.3 和13.8 cM。另外發(fā)現(xiàn)，果實(shí)的主要組分的重量、胚乳濕度和果實(shí)產(chǎn)量位于基因組中的不同位置，這表明可以通過(guò)選擇QTLs的獨(dú)立部分獲得有效的分子標(biāo)記輔助選擇收益率。已知的太平洋和大西洋中椰子分子和表型差異，可以調(diào)查研究這些分組之間雜交的椰子遺傳多樣性[18]。

3 分子標(biāo)記在椰子研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景

椰子雖為熱帶地區(qū)重要的作物之一，但是分子標(biāo)記在椰子種質(zhì)資源和育種研究中還未得到廣泛的應(yīng)用。分子標(biāo)記對(duì)于品種鑒定與分類、種質(zhì)資源的保護(hù)、親緣關(guān)系、輔助選擇育種、分子連鎖圖譜構(gòu)建等方面都有著十分重要的意義，為傳統(tǒng)的育種提供了一種有力的輔助手段。我國(guó)椰子育種工作目前應(yīng)加快種質(zhì)資源的收集以及對(duì)椰子的遺傳資源的研究，大力推廣優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種，積極引入高產(chǎn)高效外來(lái)資源，尤其可以作為母本雜交種的矮種，來(lái)滿足目前和將來(lái)的育種需要，充分的利用分子標(biāo)記技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，還應(yīng)注意尋找新型分子標(biāo)記，尋找低成本的簡(jiǎn)化分子標(biāo)記技術(shù)，改進(jìn)分析基因組的方法和技術(shù)。相信隨著分子標(biāo)記技術(shù)的日臻完善，分子標(biāo)記必將在椰子育種中發(fā)揮重要的作用，有利于椰子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為椰子產(chǎn)業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益，滿足人們對(duì)椰子產(chǎn)品生產(chǎn)和生活的需求。

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