人參多糖對NK92—MI細(xì)胞殺傷活性的影響及機(jī)制

王歡 侯殿東 陳文娜 郭勝楠 雷萍 韓曉偉 徐銘 關(guān)洪全

【摘 要】 目的：研究人參多糖對NK92-MI殺傷活性的影響及機(jī)制。方法：采用200mg/L或400mg/L GPS作用于NK92-MI細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，采用CCK-8 試劑盒檢測GPS對NK92-MI細(xì)胞殺傷活性和增殖活性的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測GPS對NK92-MI細(xì)胞活化受體（NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D）表達(dá)的影響；采用western blot技術(shù)檢測NK細(xì)胞殺傷介質(zhì)（穿孔素和顆粒酶B）表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對照組相比，GPS可明顯促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷活性，上調(diào)活化受體（NKp30、NKp44、NKp46）、殺傷介質(zhì)（穿孔素和顆粒酶B）的表達(dá)水平（P<0.05）。結(jié)論：GPS通過上調(diào)活化受體（NKp30、NKp44、NKp46）的表達(dá)促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞的活化，并且通過上調(diào)殺傷介質(zhì)（穿孔素和顆粒酶B）的表達(dá)提高NK92-MI細(xì)胞的殺傷活性。

【關(guān)鍵詞】 人參多糖；NK92-MI細(xì)胞；殺傷活性

【中圖分類號】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2017）09-0037-04

Effects of ginseng polysaccharides（GPS） on the cytotoxicity of the NK92-MI cells

WANG Huan1 HOU Diandong1 CHEN Wenna2 GUO Shengnan2 LEI Ping1 HAN Xiaowei1 XU Ming1 GUAN Hongquan1*

1.Basic Medical College， Liaonign University of China Medical University，Shenyang 116600，China；

2. Experiment and Technology Center， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 116600，China

Abstract：Objective To research the influence and mechanism of Ginseng polysaccharides（GPS） on the cytotoxicity of the NK92-MI cells.Methods CCK8 kit was adopted to detect the cytotoxicity of NK92-MI cells， Flow cytometric analysis was adopted to detect the expression of activated receptors， western blot was adopted to detect the expression level of perforin and Granzyme B.Results Compare to the normal control group， GPS could increase the cytotoxicity， expression of NKp30， NKp44， NKp46， perforin and granzymeB.Conclusion GPS can increase the cytotoxicity of NK92-MI cells by increasing expression of activated receptors， perforin and granzyme B.

Keywords：GPS； NK92-MI Cells； Cytotoxicity

人參多糖（Ginseng Polysaccharides，GPS）是中藥人參的主要活性成分之一，是一種高分子葡聚糖，主要由人參淀粉和人參果膠兩部分組成[1]。研究發(fā)現(xiàn)GPS具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、造血調(diào)控、抗疲勞和抗抑郁等作用，其中免疫調(diào)節(jié)活性尤為受重視[2]。前期的研究結(jié)果表明，GPS可明顯提高免疫抑制小鼠NK細(xì)胞的殺傷活性[3]。其機(jī)制可能為，GPS可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體整體免疫功能（比如調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的水平）而促進(jìn)NK細(xì)胞的殺傷功能；或GPS進(jìn)入機(jī)體也可能直接對NK細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步探討GPS對NK細(xì)胞的直接活化效應(yīng)及機(jī)制，采用GPS作用于NK92-MI細(xì)胞株，揭示GPS對NK細(xì)胞作用的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究GPS的免疫調(diào)節(jié)活性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 NK92-MI細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。人參多糖注射液（3mg/mL）（批號：Z20025235，沈陽雙鼎制藥公司）；CD134（NKG2D）-FITC、CD337（NKp30）-PE、CD336（NKp44）-PerCP、CD335（NKp46）-APC購自美國eBioscience公司。anti-perforin、anti-granzyme B購自美國Santa Cruz公司；α-MEM 培養(yǎng)基（美國Invitrogen 公司）。馬血清及胎牛血清（美國HYCLONE公司）；

1.2 方法

1.2.1 NK92-MI細(xì)胞培養(yǎng) 用含12.5% 胎牛血清和12.5%馬血清的α-MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理 實(shí)驗(yàn)組NK92-MI細(xì)胞分別以200mg/L或400mg/L GPS刺激，對照組加入等量PBS，24h后收集細(xì)胞。

1.2.3 NK92-MI細(xì)胞對K562 殺傷活性的測定 K562 細(xì)胞以10% FBS RPMI-1640 培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。以對數(shù)期的K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)孔加入靶細(xì)胞100μL/孔（濃度為1×105/mL），使效靶比分別為4∶1，同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對照孔、靶細(xì)胞對照孔及空白對照孔，各孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。效靶細(xì)胞共同孵育4h后，每孔加入CCK-8 液（5mg/mL）20μL，再繼續(xù)孵育1h。用酶標(biāo)儀于450nm 處測定OD值。按下列公式計(jì)算NK-92MI 細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷率： NK 細(xì)胞殺傷率（%）=[1-（殺傷實(shí)驗(yàn)組OD 值-效應(yīng)細(xì)胞對照組OD值）/靶細(xì)胞對照組OD值]×100% 。

1.2.4 流式檢測 調(diào)細(xì)胞濃度為4×105/mL，用人IgG（1μg/105）封閉Fc受體（室溫，15min）。加入10μL熒光標(biāo)記單抗（CD134（NKG2D）-FITC、CD337（NKp30）-PE、CD336（NKp44）-PerCP、CD335（NKp46）-APC），4℃避光孵育30～45min。染色后的細(xì)胞用相同PBS緩沖液洗滌3次。細(xì)胞重懸于500μL含0.5%BSA的 PBS緩沖液中，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 NK92-MI細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B蛋白表達(dá)的檢測 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，超聲處理10s，12000r/min離心5min，取上清液BCA法檢測蛋白濃度。取25μg蛋白經(jīng)10%SDS PAGE電泳分離蛋白，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，在5%脫脂奶粉的封閉液中室溫下封閉2h，分別加入穿孔素和顆粒酶B一抗4℃過夜，洗膜后，加入二抗，37℃，lh。ECL發(fā)光，信號在圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行吸光度掃描。以β-actin作為內(nèi)參，獲得蛋白相對量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±SD）表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPS對NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的影響 如表1所示，與正常對照組細(xì)胞相比，400mg/L GPS可明顯提高NK92-MI細(xì)胞殺傷活性（P<0.05）。

2.2 GPS對NK92-MI細(xì)胞活化受體表達(dá)的影響 如表2及圖1所示，200mg/L和400mg/L的GPS均可明顯或顯著上調(diào)NKp30或NKp44的表達(dá)（P<0.05或P<0.005），400mg/L的GPS均可明顯上調(diào)NKp46的表達(dá)（P<0.005）。但兩個(gè)濃度的GPS對NKG2D的表達(dá)均無明顯影響（P>0.05）。

2.3 GPS對NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B表達(dá)的影響 如圖2所示，400mg/L的GPS可有效上調(diào)NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)（P<0.005），但200mg/L的GPS對穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)均無明顯影響（P>0.05）。

3 討論

NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，是機(jī)體抵御腫瘤和病毒感染的第1道防線。NK細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用[4]。研究表明GPS增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，提高機(jī)體抗腫瘤的能力，但相關(guān)機(jī)制研究較少。NK92-MI是源自NK-92的IL-2非依賴的NK細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)采用NK92-MI細(xì)胞株研究了GPS對NK細(xì)胞的直接活化作用。NK細(xì)胞識別和殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制與其表面受體的特性密切相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)的NK細(xì)胞表面的活化性受體包括自然細(xì)胞毒受體（Natural Cytotoxicity Receptors，NCRs）、NKG2D、活化殺傷免疫球蛋白樣受體（Killer immunogloblin-Like receptors，KIRs）及其他輔助刺活化性受體等[5-6]?；罨允荏w與配體交聯(lián)結(jié)合后產(chǎn)生的激活信號導(dǎo)致NK細(xì)胞脫顆粒，釋放殺傷介質(zhì)穿孔素和顆粒酶，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[7]。NCRs為近年發(fā)現(xiàn)的一類非MHC限制的特異性啟動(dòng)NK細(xì)胞活化的表面分子，屬于免疫球蛋白超家族受體，成員包括NKp46、NKp44和NKp30。NK細(xì)胞表面的活化性受體在細(xì)胞表面的表達(dá)程度與NK細(xì)胞功能的發(fā)揮密切相關(guān)[8]。

實(shí)驗(yàn)中，與正常對照組相比，400mg/L的GPS均可明顯提高NK92-MI細(xì)胞殺傷活性，200mg/L和400mg/L的GPS均可明顯或顯著上調(diào)NKp30或NKp44的表達(dá)，400mg/L的GPS均可顯著上調(diào)NKp46的表達(dá)。并且400mg/L的GPS可顯著上調(diào)NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)。

綜上所述，研究表明GPS能提高NK92-MI細(xì)胞的殺傷活性，其機(jī)制為GPS通過上調(diào)活化受體（NKp30、NKp44、NKp46）的表達(dá)促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞的活化，并且通過上調(diào)殺傷介質(zhì)（穿孔素和顆粒酶B）的表達(dá)提高NK92-MI細(xì)胞的殺傷活性。

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（收稿日期：2017-03-08 編輯：梁志慶）