張夢(mèng)琦，陳云云，張熙，鄧輝，孫建光，高淼*，卜寧*

多功能植物根際促生菌 DD3 的功能特性及對(duì)大蒜幼苗的促生效果

張夢(mèng)琦1，陳云云2，張熙2，鄧輝2，孫建光2，高淼2*，卜寧1*

（1 沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

【目的】植物根際促生菌 (plant growth promoting rhizobacteria, PGPR) 能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害、增加作物產(chǎn)量，具有較好的環(huán)境兼容性、不易引起抗性、效果持久穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)。篩選高效多功能菌，探索抗病促生機(jī)理，對(duì)開(kāi)發(fā)防控大蒜土傳病害的微生物技術(shù)，發(fā)展“高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、生態(tài)、安全”的大蒜產(chǎn)業(yè)具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。 【方法】以實(shí)驗(yàn)室前期從山東省金鄉(xiāng)縣連作大蒜根部分離的 70 株細(xì)菌為供試菌株，篩選對(duì)大蒜根腐病病原真菌擬枝孢鐮刀菌 (Fusarium sporotrichioides) ACCC37402 和大蒜葉枯病病原真菌鏈格孢屬菌株 (Alternaria sp.) D14011-1 具有較好拮抗效果的菌株；采用 16S rDNA 基因序列同源性分析，對(duì)其進(jìn)行初步鑒定；通過(guò)測(cè)定菌株對(duì)抗生素的敏感性、水解蛋白能力、產(chǎn)鐵載體能力、產(chǎn) HCN 能力等，研究菌株的拮抗特性；通過(guò)測(cè)定菌株的固氮能力、溶磷能力、產(chǎn) IAA 能力，產(chǎn) ACC 脫氨酶能力等，研究菌株的促生特性；通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn)，進(jìn)行多功能菌菌懸液及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)大蒜幼苗生長(zhǎng)的影響以及抗病效果研究。 【結(jié)果】菌株 DD3 對(duì)大蒜根腐病病原真菌 ACCC37402 和大蒜葉枯病病原真菌 D14011-1 具有較好拮抗效果，抑菌率均為45%；經(jīng) 16S rDNA 基因序列同源性分析，初步確定為芽孢桿菌屬 (Bacillus) 菌株。其它功能特性研究結(jié)果顯示：菌株 Bacillus sp. DD3 具有水解蛋白能力、產(chǎn) HCN 能力、產(chǎn)鐵載體能力、固氮能力、溶解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的能力；對(duì)氨芐青霉素鈉、硫酸卡那霉素等 11 種抗生素?zé)o耐受性，不具有分泌吲哚乙酸 IAA 能力和產(chǎn) ACC 脫氨酶能力。盆栽試驗(yàn)顯示，接種 Bacillus sp. DD3 菌懸液對(duì)大蒜根腐病的防治效果較好，防控率達(dá) 80%。接種Bacillus sp. DD3 及其無(wú)菌發(fā)酵液后能夠促進(jìn)大蒜幼苗的生長(zhǎng)，其中接種菌懸液效果更佳。 【結(jié)論】菌株Bacillus sp. DD3 兼具多種功能特性，對(duì)大蒜根腐病具有較好的拮抗效果，同時(shí)可以顯著促進(jìn)大蒜幼苗生長(zhǎng)，有望進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)成為微生物肥料生產(chǎn)菌種。

大蒜；植物根際促生菌 (PGPR)；多功能菌；抗??；促生

大蒜 (Allium sativum L.) 屬于百合科蔥屬，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是深受世界各國(guó)人民喜愛(ài)的保健蔬菜，又是重要的調(diào)味品和醫(yī)藥原料[1–2]。隨著大蒜市場(chǎng)需求量的不斷攀升，農(nóng)民為追逐經(jīng)濟(jì)效益，主產(chǎn)區(qū)的連作現(xiàn)象日益嚴(yán)重，導(dǎo)致在正常管理下大蒜生長(zhǎng)弱、病害頻發(fā)、土壤板結(jié)、有效養(yǎng)分含量下降等連作障礙問(wèn)題，嚴(yán)重影響大蒜的產(chǎn)量和品質(zhì)，已成為制約大蒜生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要問(wèn)題[3–6]。大量研究表明，某些植物根際促生菌 (PGPR) 不僅能夠產(chǎn)生多種抗生素和嗜鐵素、蛋白酶等與拮抗相關(guān)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，有效地抑制土傳病害[7–9]；同時(shí)某些拮抗菌具有固氮、溶磷、產(chǎn) ACC 脫氨酶、產(chǎn) IAA等功能特性，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)、改善土壤的微生態(tài)環(huán)境[10–11]。如果將這些拮抗菌在連作大蒜土壤中使用，必將有效緩解、克服大蒜連作導(dǎo)致的植物生長(zhǎng)勢(shì)弱、病害嚴(yán)重等問(wèn)題，提高大蒜產(chǎn)量。因此，篩選多功能拮抗菌，探索抗病促生機(jī)理，研制防控大蒜土傳病害的微生物肥料，對(duì)發(fā)展“高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、生態(tài)、安全”的大蒜產(chǎn)業(yè)具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試細(xì)菌 70 株，為實(shí)驗(yàn)室前期從山東省金鄉(xiāng)縣連作大蒜根部分離保藏的微生物資源。大蒜根腐病病原真菌擬枝孢鐮刀菌 (Fusarium sporotrichioides) ACCC37402 和大蒜葉枯病病原真菌鏈格孢屬菌株(Alternaria sp.) D14011-1 由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (Agriculture Culture Collection of China, ACCC) 提供。供試土壤采集自山東省金鄉(xiāng)縣馬廟鎮(zhèn)卓廟村張莊連作大蒜 20 年以上的土壤。

1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，馬鈴薯 200 g，蒸餾水 1000 mL，瓊脂 15～20 g，pH 自然。

牛肉膏培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.0。

King’s B培養(yǎng)基：甘油 10 mL，蛋白胨 20.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.5 g，1.8% 瓊脂，pH 7.2。

蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，CaCl20.1 g，脫脂奶粉 10.0 g，1.8% 瓊脂，115℃ 滅菌 30 min，pH 7.2～7.4。

有機(jī)磷卵黃培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g，牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7～7.5 (臨用時(shí)每 50 mL 中加入新鮮蛋黃液 3 mL，蛋黃液按無(wú)菌生理鹽水與雞蛋黃 1∶1 配置)。

無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：KCl 0.2 g，NaCl 0.2 g，(NH4)2SO40.5 g，Ca3(PO4)25.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.02 g，葡萄糖10.0 g，蒸餾水 1000 mL，瓊脂 20.0 g，pH 7～7.5。

無(wú)氮培養(yǎng)基[12]：K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 0.12 g，CaCO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，瓊脂 20.0 g。

DF培養(yǎng)基：KH2PO44.0 g，Na2HPO46.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO42.0 g，葡萄糖 2.0 g，葡萄糖酸鈉 2.0 g，檸檬酸 2.0 g，組分一、組分二溶液各 0.1 mL，蒸餾水 1000 mL，pH 7.2。組分一：MnSO4·H2O 11.19 mg，CuSO4·5H2O 78.22 mg，ZnSO4·7H2O 124.6 mg，H3BO310.0 mg，MoO310.0 mg溶于 100 mL 無(wú)菌水中。組分二：FeSO4·7H2O 100.0 mg溶于 10 mL 無(wú)菌水中。

ADF 培養(yǎng)基：ACC 溶于去離子水后過(guò)濾滅菌，加到不含 (NH4)2SO4且滅好菌的 DF 培養(yǎng)基中，ACC終濃度為 3.0 mmol/L。

1.3 兩點(diǎn)對(duì)峙實(shí)驗(yàn)方案

利用兩點(diǎn)對(duì)峙法，測(cè)定菌株對(duì)病原真菌的拮抗能力[13]。選用 PDA 平板，在距離平板中心 2 cm 的位置做上兩點(diǎn)圓點(diǎn)標(biāo)記，將大蒜土傳根腐病病原真菌ACCC37402 和大蒜葉枯病病原真菌 D14011-1 分別準(zhǔn)確接在其中一點(diǎn)上，并將取 2 μL 待測(cè)菌液點(diǎn)于另一圓點(diǎn)，設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。在培養(yǎng)箱里面 28℃ 培養(yǎng) 7 d后，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，拍照記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，測(cè)定其抑菌半徑。抑菌直徑和抑菌率計(jì)算：

抑菌直徑 = 對(duì)照病原真菌直徑 – 與拮抗菌對(duì)峙的病原真菌直徑

抑菌率 = (對(duì)照病原真菌直徑 – 與拮抗菌對(duì)峙的病原真菌直徑)/對(duì)照病原真菌直徑 × 100%

1.4 菌株16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

挑取少量單菌落，放入盛有 100 μL 無(wú)菌水的 EP管中，95℃ 加熱 15 min 后迅速放入 –20℃ 冰箱1 min，12000 r/min 離心 2 min，4℃ 保存，用時(shí)取上清液為模板[14]。

PCR 擴(kuò)增 16Sr DNA 序列，引物采用 16S rDNA的通用引物，DNA 片段大小約 1500 bp，由上海生工合成。引物 1 (27f)，5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′；引物 2 (1492r)，5′-TACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3′。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系[15]：2 × mixTaq (購(gòu)自 TaKaRa 公司) 25 μL，引物 (10 μmol/L) 1 μL，模板 2 μL，用去離子水補(bǔ)足到 50 μL 體系。反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性 5 min、95℃ 變性 1 min、55℃ 退火1 min、72℃ 延伸 2 min，35 個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 再延伸 10 min，4℃ 保存。

PCR 產(chǎn)物用含有 0.5 μg/mL 溴化乙錠的 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取 4 μL 的擴(kuò)增產(chǎn)物和 1 μL loading buffer 混勻上樣，200 V，電泳 15 min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，送北京生工有限責(zé)任公司測(cè)序。獲得序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行序列在線比對(duì)，采用Mega軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 菌株拮抗特性測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.5.1 抗生素敏感性能力檢測(cè) 采用抑制菌圈法測(cè)定拮抗菌對(duì)抗生素敏感性[16]。將拮抗菌培養(yǎng)液均勻地涂布于 NA 平板表面，同時(shí)以無(wú)菌鑷子夾取含氨節(jié)青霉素鈉、鏈霉素、鹽酸四環(huán)素等 11 種常見(jiàn)抗生素的紙片 (紙片含量 10 μL/紙片) 置于含菌平板上，30℃培養(yǎng) 48 h 后，取出觀察測(cè)定抑菌圈的大小。

1.5.2 產(chǎn)蛋白酶能力檢測(cè) 采用透明圈法測(cè)定[17]。將待測(cè)菌株接種于蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基，置于 30℃ 培養(yǎng)2 d。觀察菌落周圍透明圈大小可判斷菌株的蛋白質(zhì)水解能力。

1.5.3 產(chǎn) HCN 能力檢測(cè) King’s B培養(yǎng)基中加入 4.4 g/L的甘氨酸，將拮抗菌培養(yǎng)液均勻地涂布于 King’s B培養(yǎng)基中，用無(wú)菌鑷子夾取浸入過(guò) 0.05% 苦味酸 (三硝基苯酚) 和 2% Na2CO3混合溶液的濾紙，置于培養(yǎng)皿中間，平皿四周用封口膜封住防止漏氣。置于30℃ 培養(yǎng) 2 天。HCN 與苦味酸在 Na2CO3存在下顏色發(fā)生變化，依次呈現(xiàn)深黃、橘色、橘棕、深棕，由此可判斷 HCN 的產(chǎn)生[18]。

1.5.4 產(chǎn)鐵載體能力檢測(cè) 菌株產(chǎn)鐵載體能力定性測(cè)定參考 Schwyn 等藍(lán)色定性檢測(cè)培養(yǎng)基[19]。然后按每皿 30 mL 傾注于培養(yǎng)皿 (Φ 90 mm) 中，以在 CAS 檢測(cè)平板上出現(xiàn)橘黃色暈圈的菌株為供試菌株，定性為產(chǎn)鐵載體陽(yáng)性菌。

1.6 菌株促生特性測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.6.1 溶磷能力測(cè)定 采用平板篩選法測(cè)定溶磷能力[20]?；罨┰嚲?，制成菌懸液，分別取 2 μL 點(diǎn)接于有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板上，無(wú)機(jī)磷源為Ca3(PO4)2，有機(jī)磷源為新鮮蛋黃液，每各處理三個(gè)重復(fù)，28℃ 培養(yǎng) 14 天。觀察菌株周圍能否形成透明圈，判斷其是否具有溶磷能力。

1.6.2 固氮能力測(cè)定 將待測(cè)菌株分別接種于無(wú)氮平板上，再?gòu)臒o(wú)氮平板上挑取菌落在新的無(wú)氮平板上劃線，28℃ 培養(yǎng)，在第 3 天目測(cè)其生長(zhǎng)狀況，平板上有菌落的為陽(yáng)性。篩選有固氮能力的細(xì)菌進(jìn)行固氮酶活性測(cè)定。

采用乙炔還原法[15]測(cè)定菌株固氮酶活性。15 mm × 150 mm 螺口試管中加入 5 mL 無(wú)氮培養(yǎng)基制成斜面，接種固氮菌。28℃ 培養(yǎng) 72 h 后換橡膠塞，注入乙炔氣體至終濃度為 10%，繼續(xù)培養(yǎng) 72 h。取 100 μL反應(yīng)氣體，氣相色譜儀測(cè)定乙烯生成量；菌體蛋白量測(cè)定用 5 mL 生理鹽水洗滌、收集上述固氮酶測(cè)定后的斜面菌體，加入 3 mL 0.5 mol/L NaOH 煮沸 5 min，加入 3 mL 0.5 mol/L HCl，離心，取上清 1.0 mL 加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)，混合、顯色 3 min，測(cè)定 595 nm處的吸光值。根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌體蛋白量。固氮酶活性 [nmol/(mg·h), protein] = C2H4(nmol)/[菌體蛋白量 (mg, protein) × 反應(yīng)時(shí)間 (h)]。

1.6.3 IAA 能力測(cè)定 采用比色法測(cè)定菌株產(chǎn) IAA 的能力[21]。菌株在 DF 培養(yǎng)基中過(guò)夜生長(zhǎng)，然后轉(zhuǎn)移到含 0.1% L-色氨酸的 DF 培養(yǎng)基中。菌株在 28℃ 條件下培養(yǎng) 7 天，然后 8000 r/min 離心 10 分鐘。1 mL 的懸浮液混合 2 mL 的 Fe-H2SO4溶液 (取 1 mL 的 0.5 mol/L FeCl3·6H2O 溶液到 74 mL 的 6.13 mol/L H2SO4中) 暗室放置 45 min，IAA 濃度計(jì)算通過(guò)測(cè)量樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度在 450 nm 處的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.4 ACC 脫氨酶活性菌株的篩選 參考 Glick 的方法[22]，將菌種接入 5 mL 固氮液體培養(yǎng)基，28℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng) 24 h，吸取 0.1 mL 懸浮液至 5 mL 的DF 培養(yǎng)基中，同條件繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，吸取 0.1 mL懸浮液至 5 mL 的 ADF 培養(yǎng)基中，同條件繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。將可在 ADF 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌種再轉(zhuǎn)接一次，用不含 ACC 的 ADF 培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。分別以不接菌的 ADF 和不含 ACC 的 ADF 培養(yǎng)基調(diào)零，測(cè)定 600 nm 處菌液的吸光度值，確定 ACC 脫氨酶的陽(yáng)性菌株。

1.7 溫室條件下多功能菌 Bacillus sp. DD3 (DD3)對(duì)大蒜根腐病 ACCC37402 的抗病能力試驗(yàn)設(shè)計(jì)

處理分別為接種大蒜根腐病原真菌 ACCC37402的孢子液 (后簡(jiǎn)稱 37402)、37402 + DD3 菌懸液、37402 + DD3 的無(wú)菌發(fā)酵液，對(duì)照為不接菌。將大蒜根腐病病原真菌 ACCC37402 接到 PDA 液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min 培養(yǎng) 7 d，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)量，用無(wú)菌水配制成濃度為 2 × 107cfu/mL 的孢子液；將 DD3 接到牛肉膏培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min培養(yǎng) 2 d，用無(wú)菌水配制為 OD600= 1、有效活菌數(shù)為1.8 × 106cfu/mL 菌懸液。

將肥料與滅菌土壤攪拌均勻后裝到花盆中，澆透水備用。將大蒜剝皮后在水中浸泡一夜瀝干放入4℃ 冰箱內(nèi) 12 小時(shí)拿出。選取重量、蒜高基本一致的蒜種播種于花盆中，每個(gè)花盆種 5 個(gè)蒜瓣 (如果出苗不好，后期需要補(bǔ)苗)，處理和對(duì)照各 2 盆。待大蒜苗高約 5 cm 時(shí)，每株大蒜處理 1 為接 10 mL 根腐病病原真菌 37402 + 10 mL 清水，處理 2 為接 10 mL根腐病病原真菌 37402 + DD3 菌懸液 10 mL，處理 3 為接 10 mL 根腐病病原真菌 37402 + 無(wú)菌發(fā)酵液 10 mL，對(duì)照加 20 mL 清水。40 d 后，觀察大蒜的感病和抗病情況，根據(jù)張博的方法[23]確定根腐病原菌的致病力，測(cè)定大蒜株高、莖粗、株鮮重、株干重，分析DD3 以及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)感病大蒜幼苗生長(zhǎng)的影響。根據(jù)大蒜植株莖基部與根部發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率與防治效果[23]。防治效果 = (對(duì)照組發(fā)病株數(shù) –防治組發(fā)病株數(shù))/對(duì)照組發(fā)病株數(shù) × 100%

1.8 溫室條件下菌株 DD3 對(duì)大蒜幼苗的促生能力試驗(yàn)設(shè)計(jì)

處理為接種 OD600= 1、有效活菌數(shù)為 1.8 × 106cfu/mL 的 DD3 菌懸液、DD3 無(wú)菌發(fā)酵液，對(duì)照為不接菌。將菌株 DD3 接到牛肉膏培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min 下培養(yǎng) 2 d。

將肥料與滅菌土壤攪拌均勻后裝到花盆中，澆透水備用。將大蒜剝皮后在水中浸泡一夜瀝干放入4℃ 冰箱內(nèi) 12 h 拿出。選取重量、蒜高基本一致的蒜種播種于花盆中，每個(gè)花盆種 2 個(gè)蒜瓣 (如果出苗不好，后期需要補(bǔ)苗)，處理和對(duì)照各 5 盆。待大蒜苗高約 5 cm 時(shí)，每株大蒜接 DD3 菌懸液 10 mL、無(wú)菌發(fā)酵液 10 mL，對(duì)照處理加 10 mL 清水。40 d后，觀察大蒜的長(zhǎng)勢(shì)，測(cè)定大蒜株高、莖粗、株鮮重、株干重，分析多功能菌 DD3 及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)大蒜幼苗生長(zhǎng)的影響。

1.9 數(shù)據(jù)處理

單因素方差分析采用 SPSS16.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn) (F > 0.05)，處理間多重比較采用 LSD 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜根腐病和葉枯病拮抗菌的篩選

以實(shí)驗(yàn)室前期從山東省金鄉(xiāng)縣連作大蒜根部分離的 70 株細(xì)菌為研究對(duì)象，以大蒜根腐病病原真菌擬枝孢鐮刀菌 (Fusarium sporotrichioides) ACCC37402和大蒜葉枯病病原真菌鏈格孢屬菌株 (Alternaria sp.) D14011-1 為對(duì)峙菌株，經(jīng)兩點(diǎn)對(duì)峙實(shí)驗(yàn)篩選獲得一株細(xì)菌 DD3 對(duì)大蒜根腐病 ACCC37402 和葉枯病 D14011-1均具有明顯的拮抗效果 (圖 1)，抑菌率均為 45%。

2.2 菌株 DD3 的 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析

以篩選獲得的高效拮抗菌 DD3 的總 DNA 為模板，采用 16S rDNA 通用引物 27F 和 1492R，PCR 擴(kuò)增到 16S rDNA 基因大小約 1.5 kb。測(cè)序結(jié)果經(jīng)http://ezbiocloud.net/ 數(shù)據(jù)庫(kù)在線比對(duì)，結(jié)果顯示菌株DD3 的 16S rDNA 基因序列最高相似性菌株為沙漠枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T(AMXN01000021)，最高相似度為99.36%。采用鄰近法，構(gòu)建菌株 DD3、5 株與其高相似性芽胞桿菌屬 (Bacillus) 菌株以及兩個(gè)類芽胞桿菌屬菌株的 16S rDNA 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù) (圖 2)，結(jié)果顯示高效拮抗菌 DD3 與其 16S rDNA 基因序列最高相似性菌株 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T位于同一分支，說(shuō)明它們具有高度同源性。經(jīng) 16S rDNA 序列分析，將菌株 DD3 初步鑒定為芽胞桿菌屬菌株 Bacillus sp。

2.3 菌株 DD3 的拮抗特性研究

表1 結(jié)果顯示，菌株 DD 對(duì)氨芐青霉素鈉、硫酸卡那霉素、青霉素鈉、噻孢霉素等 11 種抗生素均無(wú)耐受性。

菌株 DD3 能在蛋白酶檢測(cè)平板上出現(xiàn)明顯透明水解圈 (圖 3)，表明其具有蛋白水解能力；在 King’s B 培養(yǎng)基上，含菌株 DD3 的濾紙出現(xiàn)深黃色變化(圖 3)，說(shuō)明其具有產(chǎn) HCN 能力；菌株 DD3 可以使CAS 藍(lán)色檢測(cè)液產(chǎn)生橘黃色透明圈 (圖 3)，說(shuō)明其具有產(chǎn)鐵載體能力。

2.4 菌株 DD3 的促生特性研究

菌株 DD3 經(jīng)過(guò)兩次檢測(cè)，都能在無(wú)氮平板上生長(zhǎng)，初步判定其都具有固氮能力，經(jīng)乙炔還原法測(cè)定，菌株 DD3 的固氮酶活性為 0.41 ± 0.09 nmol/(mg·h)；菌株 DD3 能在有機(jī)磷培養(yǎng)基上和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上形成透明圈 (圖 4)，說(shuō)明其同時(shí)具有溶解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的能力；在含 0.1% L-色氨酸的 DF 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，與 Fe-H2SO4溶液不能發(fā)生顏色反應(yīng)，說(shuō)明其不具有產(chǎn) IAA 能力；在 ADF 培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌不具有產(chǎn) ACC 脫氨酶能力。綜上，菌株 Bacillus sp. DD3 具有多種抗病和促生特性。

2.5 溫室條件下菌株 DD3 對(duì)大蒜根腐病 ACCC37402的抗病能力研究

圖1 菌株 Bacillus sp. DD3 對(duì)大蒜根腐病和葉枯病病原真菌的拮抗能力Fig. 1 Antagonistic ability of Bacillus sp. DD3 against pathogenic fungi of garlic root rot and garlic leaf blight[注（Note）：37402—大蒜根腐病病原真菌擬枝孢鐮刀菌 Pathogenic fungi of garlic root rot (Fusarium sporotrichioides); D14011-1—大蒜葉枯病病原真菌鏈格孢菌 Pathogenic fungi of garlic leaf blight (Alternaria sp.).]

圖2 菌株 Bacillus sp. DD3 系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of Bacillus sp. DD3

表1 菌株 Bacillus sp. DD3 的功能特性Table1 The functional characterizations of Bacillus sp. DD3

圖3 菌株 Bacillus sp. DD3 水解蛋白、產(chǎn) HCN、產(chǎn)鐵載體能力Fig. 3 Capacity of producing hydrolysis protein, HCN and siderophore of Bacillus sp. DD3

圖4 菌株 Bacillus sp. DD3 溶磷能力Fig. 4 Phosphate solubilizing ability of Bacillus sp. DD3

接入大蒜根腐病病原真菌 ACCC37402 孢子液的大蒜根腐病發(fā)病率為 100%，對(duì)發(fā)病植株病健交界處進(jìn)行再分離，經(jīng)鑒定，再分離菌株與接種菌株完全相同，確認(rèn) ACCC37402 對(duì)大蒜具有致病力。經(jīng)有效活菌計(jì)數(shù)，吸光值 OD600= 1 的 DD3 菌懸液活菌濃度為 1.8 × 106cfu/mL。接入菌懸液后可達(dá)到良好的抗病效果，抗病率達(dá) 80%，接入無(wú)菌發(fā)酵液后，抗病率為 30%。感染根腐病后的大蒜幼苗，在接種 DD3菌懸液和其無(wú)菌發(fā)酵液后，在株高、莖粗、株鮮重、株干重與感染根腐病的大蒜相比都有增加；SPSS 分析顯示，與感病大蒜幼苗相比，接菌懸液和無(wú)菌發(fā)酵液后大蒜株高、株鮮重和株干重達(dá)到顯著性差異，莖粗差異不顯著。與不接菌對(duì)照相比，接菌懸液和無(wú)菌發(fā)酵液后大蒜各指標(biāo)差異均不顯著 (表 2)?？梢?jiàn)，多功能菌 Bacillus sp. DD3 菌懸液可以達(dá)到較好的拮抗病原微生物的作用 (圖 5)。

2.6 溫室條件下菌株 DD3 對(duì)大蒜幼苗的促生能力研究

接菌后第 40 天收獲蒜，分別測(cè)定大蒜株高、莖粗、株鮮重、株干重，結(jié)果顯示，接種 DD3 菌懸液(DD3MB) 后大蒜莖粗、株高、株鮮重、株干重等與未接菌對(duì)照相比都有增加；接種無(wú)菌發(fā)酵液 (DD3AFL)后大蒜莖粗、株高、株鮮重、株干重等與未接菌對(duì)照相比也有增加，但增加效果不如菌懸液效果明顯(圖 6 )。SPSS 分析顯示，與不接菌對(duì)照相比，接菌懸液后大蒜株高和莖粗達(dá)到顯著性差異，株鮮重和株干重達(dá)到極顯著差異。與不接菌對(duì)照相比，接無(wú)菌發(fā)酵液后大蒜株鮮重和株干重達(dá)到顯著性差異 (表 3)，可見(jiàn)，DD3 菌懸液及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)大蒜幼苗均具有一定的促生作用，DD3 菌懸液的促生效果更佳。

3 討論

植物根際促生菌 (PGPR) 對(duì)土壤中非寄生性根際有害微生物與有害病原微生物起到生防作用，促進(jìn)植物礦質(zhì)元素的吸收和利用，可產(chǎn)生利于植物生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[24]。芽胞桿菌(Bacillus) 作為一類重要的能拮抗病原真菌的 PGPR，部分菌株已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用[25]。崔北米等[26]從大蒜鱗莖中分離內(nèi)生細(xì)菌 19 株，其中菌株 Bacillus axarquiensis DSP6 對(duì) 9 種病原真菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。Solanki 等[27]分離到使立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani) 病害分別減少 69.8% 和 61.5% 的解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens) MB101 和枯草芽胞桿菌 (Bacillus subtilis) MB14?？莶菅挎邨U菌 (Bacillus subtilis) 是一類好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，具有豐富多樣的生理特征，在自然界中大量存在，并能產(chǎn)生抗逆性休眠體—芽孢，進(jìn)而適應(yīng)惡劣的環(huán)境，存活期較長(zhǎng)[28]?？莶菅挎邨U菌能產(chǎn)生多種抑制植物病原真菌的抗菌物質(zhì)，且對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境，因而在生物防治植物病害中起著重要的作用[29]。本研究從大蒜根際分離篩選獲得的細(xì)菌 Bacillus sp. DD3，16S rDNA 序列最高相似性菌株為沙漠枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum (99.4%)，對(duì)大蒜根腐病病原真菌 ACCC37402 和大蒜葉枯病病原真菌 D14011-1 均具有明顯的拮抗效果。

表2 接種多功能菌 Bacillus sp. DD3 及其無(wú)菌發(fā)酵液 (AFL) 感病大蒜幼苗的生長(zhǎng)Table2 Growth of susceptible garlic seedlings inoculated with multifunctional Bacillus sp. DD3 and its axenic fermentation liquid (AFL)

圖5 菌株 Bacillus sp. DD3 及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)大蒜幼苗的抗病效果Fig. 5 Disease-resistance of garlic seedlings of Bacillus sp. DD3 suspension and its axenic fermentation liquid

圖6 菌株 Bacillus sp. DD3 及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)大蒜幼苗促生效果Fig. 6 Promoting effect on garlic seedlings of Bacillus sp. DD3 and its axenic fermentation liquid

表3 接種 Bacillus sp. DD3 菌懸液 (MB) 和無(wú)菌發(fā)酵液 (AFL) 大蒜幼苗的生長(zhǎng)Table3 Growth of garlic seedlings inoculated with Bacillus sp. DD3 suspension and its axenic fermentation liquid

研究發(fā)現(xiàn)，具有較好應(yīng)用前景或者已經(jīng)在農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用的抗病植物根際促生菌 (PGPR) 一般都兼具多種抗病促生機(jī)制，產(chǎn)生抗生素、蛋白酶、HCN等與拮抗相關(guān)的次級(jí)代謝產(chǎn)物的 PGPR，可以有效地抑制土傳病害[8–9]；產(chǎn)鐵載體 PGPR，可以融合土壤中的鐵元素供植物利用，還可以與病原菌爭(zhēng)奪鐵元素，抑制病原菌繁殖[30]；具有固氮、解磷能力的PGPR，在一定程度上可以為自身和植物提供可利用氮和磷，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[20, 24]。Burkholderia sp. 7016 能促進(jìn)番茄生長(zhǎng)，具有固氮、溶磷、產(chǎn) ACC 脫氨酶活性和拮抗土傳病害等功能特性[20]。Pseudomonas aeruginosa PM389 能促進(jìn)狗尾草藜生長(zhǎng)，具有拮抗土傳病害、產(chǎn)鐵載體、固氮、溶磷等功能特性[30]。Lin 等[11]篩選到能拮抗真菌病害的芽胞桿菌 21 株，同時(shí)具有固氮能力和產(chǎn) IAA 能力，對(duì)黃瓜根腐病具

有明顯抑制作用，并能促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)。本文篩選獲得拮抗多種病原真菌的菌株 Bacillus sp. DD3 具有解蛋白能力、產(chǎn) HCN 能力、產(chǎn)鐵載體能力、對(duì)大觀霉素具有耐受性、固氮能力、溶解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的能力。盆栽試驗(yàn)顯示，接種 Bacillus sp. DD3 菌懸液可以使大蒜根腐病的防控效果達(dá)到 80%，接種Bacillus sp. DD3 菌懸液及其無(wú)菌發(fā)酵液后對(duì)大蒜幼苗具有一定的促生作用，其中菌懸液要比其無(wú)菌發(fā)酵液抗病促生效果更強(qiáng)?？梢?jiàn)，多功能菌 Bacillus sp. DD3 兼具多種功能特性且對(duì)大蒜幼苗具有較好的促生效果，為防治大蒜土傳病害、促進(jìn)大蒜生長(zhǎng)提供優(yōu)良菌種資源。但是，本研究篩選的 Bacillus sp. DD3 功能特性是在室內(nèi)純培養(yǎng)的條件下進(jìn)行，促生試驗(yàn)是在溫室可控條件下開(kāi)展的，在自然條件下菌株的拮抗促生效果一定會(huì)受土壤、植物、氣候、土著微生物等諸多因素的影響。因此，該菌株是否能作為農(nóng)業(yè)微生物菌劑應(yīng)用，還需要大量的試驗(yàn)來(lái)探討。

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Characterizations of rhizobacteria DD3 and their growth promoting effect on garlic seedlings

ZHANG Meng-qi1, CHEN Yun-yun2, ZHANG Xi2, DENG Hui2, SUN Jian-guang2, GAO Miao2*, BU Ning1*
( 1 College of Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang, Liaoning 110034, China; 2 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China )

【Objectives】Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) can promote plant growth, control disease and improve the crop yield, and have some advantages with environmental compatibility, no-resistance, lasting stability, and so on. Screening efficient multi-functional bacteria, researching on the mechanism of disease control and promoting growth have very important theoretical and realistic significance for development prevention and control microbial technology for garlic soil borne disease and the garlic industry of“high-yield, high-quality, high efficiency, ecology, safe”. 【Methods】 In this study, seventy bacteria ofprophase isolated from the rhizosphere of garlic in Jinxiang county of Shandong province were tested to screen bacteria with the ability of inhibiting the pathogenic fungi (Fusarium sporotrichioides) ACCC37402 and (Alternaria sp.) D14011-1. Bacteria were identified by 16S rDNA sequence analysis. The antagonistic characterizations were studied by measuring the sensitivity to antibiotic, the capability to hydrolyze proteins, the production of siderophore and hydrogen cyanide (HCN). The promoting characterizations was studied by measuring the ability to fix nitrogen and solubilize phosphate, and the production of indole-3-acetic acid (IAA) and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase. The greenhouse pot experiments were set up to study how the multi-functional bacteria and axenic fermentation extracts effect on the garlic seedling growth and disease resistance. 【Results】The bacterium DD3 was screened for antagonistic activity against the pathogenic fungi ACCC37402 (Fusarium sporotrichioides) and (Alternaria sp.) D14011-1, it showed antifungal index value of 45% inhibition to both pathogenic fungi. This strain was identified as Bacillus sp. based on 16S rDNA sequence analysis. Other functional characterizations’ results showed that the strain Bacillus sp. DD3 had the ability to proteolysis, the production of hydrogen cyanide (HCN) and siderophore, nitrogenase activity, and phosphate solubilizing ability. But, the strain DD3 did not present the sensitivity to ampicillin sodium, kanamycin sulfate and other eleven kinds of antibiotics. It produced the indole-3-acetic acid (IAA) and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase. In greenhouse experiments, 80% garlic plants inoculated with strain Bacillus sp. DD3 showed positive effect of prevention and control of root rot. Inoculation with both bacterial suspension and axenic fermentation of strain Bacillus sp. DD3 liquid promoted the growth of garlic seedlings，and the inoculation of strain Bacillus sp. DD3 suspension provided the optimum result. 【Conclusions】 Bacillus sp. DD3 with multifunctional characterizations showed antagonistic effects to garlic root rot and growth promoting of garlic seedlings. Therefore, Bacillus sp. DD3 has the potential to be developed as microbial fertilizer.

garlic; plant growth promoting rhizobacteria (PGPR); multifunctional bacterium; disease-resistant; promotion

2016–04–13 接受日期：2017–03–10

中央級(jí)公益性科研院所專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（IARRP-2015-17）資助。

張夢(mèng)琦（1991—），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，主要從事微生物資源與應(yīng)用研究。E-mail：423711258@qq.com * 通信作者 E-mail：gaomiao@caas.cn；309226126@qq.com