孫海新+孫丕春+劉偉+張慧

摘 要：本研究建立羊肉與鴨肉的分子生物學(xué)鑒別方法，以羊肉和鴨肉線粒體細(xì)胞色素b基因（cytb）為特征靶基因，設(shè)計(jì)1 條通用上游引物F和2 條特異性下游引物：R羊、R鴨，并按照一定濃度比例組成混合引物，進(jìn)行一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增即可獲得目的DNA片段，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的DNA條帶大小來判斷羊肉中是否摻雜鴨肉。結(jié)果表明：當(dāng)被檢樣本在367 bp和480 bp處分別出現(xiàn)特異性條帶時(shí)，說明該樣本的羊肉中摻雜了鴨肉；當(dāng)被檢樣本在367 bp處出現(xiàn)特異性條帶，而在480 bp處未出現(xiàn)特異性條帶時(shí)，則說明該樣本的羊肉中沒有摻雜鴨肉。該方法準(zhǔn)確、可靠、簡單快捷，可用于食品中肉類種屬的篩選和肉類摻假的檢測和監(jiān)管。

關(guān)鍵詞：羊肉；鴨肉；分子生物學(xué)；鑒別

Abstract： This study has established a molecular biological method for the identification of mutton adulterated with duck meat. Based on the target genes， namely the mitochondrial cytochrome b gene （cytb） sequences of mutton and duck， we designed one universal forward primer （F） and two specific reverse primers （Rmutton and Rduck） and mixed them in a certain proportion. The target DNA fragments were obtained by one cycle of polymerase chain reaction （PCR） amplification. By the sizes of the DNA bands in the agarose gel， we judged whether the mutton was adulterated with duck. Results indicated that duck adulteration in the tested samples could be confirmed by the appearance of specific bands at both 367 and 480 bp. On the other hand， the appearance of specific bands at 367 bp but not at 480 bp could not confirm mutton adulteration with duck. The proposed method in this study was accurate， reliable， simple， quick and useful for meat species screening and the detection and supervision of adulterated meat.

Key words： mutton； duck； molecular biology； identification

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201705009

中圖分類號(hào)：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）05-0046-05

羊肉性溫，中醫(yī)認(rèn)為進(jìn)食羊肉可以補(bǔ)虛益氣，促進(jìn)人體血液循環(huán)，提高抵抗力，因此羊肉成為冬季滋補(bǔ)及抗寒的重要食物來源[1]。近年來，隨著生活水平的不斷提高，羊肉及其制品的消費(fèi)量不斷上升，涮羊肉、烤羊肉等都深受消費(fèi)者的喜愛[2]。然而部分商販為了獲取不法利益，利用食品質(zhì)量檢測手段的不足，用價(jià)格相對(duì)低廉的肉類冒充羊肉或者將其摻入羊肉中進(jìn)行販賣，尤其是羊肉卷和羊肉串等加工后的羊肉制品，消費(fèi)者難以從形態(tài)紋理和肉質(zhì)口感上對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，這種摻假造假的行為嚴(yán)重干擾市場秩序，影響消費(fèi)者的身體健康和合法權(quán)益[3-5]，因此加強(qiáng)對(duì)該類食品的品質(zhì)鑒別十分必要。

早期的肉源鑒別技術(shù)主要依靠光譜、色譜及酶聯(lián)免疫吸附測定等技術(shù)[6-10]，但因操作復(fù)雜、耗時(shí)耗力且對(duì)樣品要求高而不能滿足對(duì)肉制品進(jìn)行準(zhǔn)確、快速鑒別的需求。隨著基因工程的普及推廣，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測為代表的分子生物學(xué)檢測手段已成為各類食品摻假檢測的標(biāo)準(zhǔn)化方法[11-12]，也是轉(zhuǎn)基因食品判別技術(shù)研究的熱點(diǎn)方向。

根據(jù)線粒體基因組DNA序列差異設(shè)計(jì)物種特異性引物在常規(guī)PCR方法中已見報(bào)道[13-14]，但多數(shù)方法一次只能擴(kuò)增一個(gè)目的片段，如果單獨(dú)檢測每一個(gè)項(xiàng)目，則存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、步驟繁瑣和消耗試劑量大等弊端。因此，亟需建立一套準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好且特異性強(qiáng)的分子生物學(xué)檢測方法，為規(guī)范市場秩序、保障食品安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊肉、鴨肉、雞肉和牛肉樣品均購買于農(nóng)貿(mào)市場。

動(dòng)物組織全基因組提取試劑盒 北京全式金公司；Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、瓊脂糖 生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTP、核糖核酸酶A、DS2000 DNA Marker、1 kb DNA Ladder Marker、蛋白酶K溶液、膠回收試劑盒 日本TaKaRa公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermal Cycler PCR儀 美國Hybaid公司；Dyy-11凝膠電泳儀及電泳槽 中國六一機(jī)械廠；AlphaImager HP凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha Inotech公司；Microfuge 22R高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

1.3.1.1 純?nèi)鈽覦NA提取

稱取羊肉、鴨肉、雞肉和牛肉各20 mg左右，分別置于研缽中用液氮研磨至粉末，使用DNA提取試劑盒提取各肉樣總DNA。并對(duì)提取得到的DNA進(jìn)行純化，除去殘存蛋白質(zhì)和RNA，使用紫外分光光度儀和凝膠電泳測試DNA的濃度及純度，并將DNA稀釋至質(zhì)量濃度為20 ng/μL備用。

1.3.1.2 羊肉、鴨肉混合樣品的制備及DNA提取

分別稱取99 g羊肉和1 g鴨肉，將兩者絞碎并混合，再用電動(dòng)組織勻漿器進(jìn)行研磨、勻漿，制成摻雜鴨肉的混合肉樣，取20 mg混合肉樣按1.3.1.1節(jié)的方法提取其DNA并進(jìn)行檢測，將DNA稀釋至質(zhì)量濃度為20 ng/μL備用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

在GenBank中檢索得到羊（accession EM130780.1）和鴨的線粒體基因序列（accession KC466567.1）。通過LaserGene中的MegAlign工具在基因庫中分析和比對(duì)羊、鴨的線粒體基因保守序列，確定針對(duì)不同物種線粒體細(xì)胞色素b基因（cytb）中的特定片段，分別設(shè)計(jì)2 種物種的相同上游引物F和具有各自物種特異性的下游引物（羊引物R羊、鴨引物R鴨），引物信息詳見表1。

1.3.3 引物特異性驗(yàn)證

分別用羊肉、鴨肉、雞肉和牛肉的全基因組作為PCR擴(kuò)增模板，加入羊肉特異性引物（F/R羊）得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，驗(yàn)證羊肉引物的特異性。鴨肉引物（F/R鴨）的特異性驗(yàn)證同羊肉引物。

1.3.4 羊肉、鴨肉成分的鑒定

將羊肉特異性引物和鴨肉特異性引物混合，使用提取的羊肉、鴨肉及其混合肉樣的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，多次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以確定引物配比，其最佳反應(yīng)體系見表2。

最佳PCR反應(yīng)條件為：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；50 ℃、30 s；72 ℃、30 s；32 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。

1.3.5 羊肉真?zhèn)舞b別

隨機(jī)抽取在售羊肉5 批，按照1.3.1.1節(jié)的方法提取肉樣DNA，并按照1.3.4節(jié)進(jìn)行PCR檢測和凝膠電泳，鑒定此5 批肉樣中是否含有鴨肉成分。將市售羊肉PCR檢測擴(kuò)增出的條帶進(jìn)行切膠回收，分別送至青島擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中羊和鴨的線粒體Cytb基因序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉樣DNA質(zhì)量及純度檢測

采用1.3.1節(jié)中的方法提取的羊肉、鴨肉、雞肉、牛肉及混合樣的DNA凝膠電泳結(jié)果見圖1。

由圖1可知，所有樣品的條帶清晰，無明顯拖帶且電泳孔亮度不明顯，說明提取的總DNA無降解、無蛋白質(zhì)殘留。用紫外分光光度儀測得DNA樣品的OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0之間，符合進(jìn)行PCR的要求。

2.2 引物特異性檢測

基于PCR手段對(duì)樣品進(jìn)行鑒別時(shí)，首先必須確定合成的引物是否具有特異性，以確保用此引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)能得到特異性目的片段，進(jìn)而確定其能否滿足檢測需要。按1.3.3節(jié)的方法分別使用羊肉引物（F/R羊）、鴨肉引物（F/R鴨）對(duì)4 種肉樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2～3。

由圖2～3可知，僅在羊肉樣品中檢測到單一目的條帶，而在其他肉類中未檢測到條帶，說明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的羊肉引物（F/R羊）具有特異性；使用鴨肉引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，同樣僅在鴨肉中檢測到明顯的目的條帶，說明設(shè)計(jì)的鴨肉引物（F/R鴨）特異性良好。

2.3 羊肉中鴨肉成分的鑒定

按1.3.4節(jié)配制PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，羊肉、鴨肉及其混合肉樣的電泳結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，經(jīng)過調(diào)整引物比例和優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)，在相同的反應(yīng)體系下，單一模板及混合模板的PCR產(chǎn)物條帶均清晰、單一，并與引物設(shè)計(jì)中的預(yù)期條帶大小一致，且混合模板的電泳條帶差別明顯，說明本研究用于羊肉中鴨肉摻假鑒別的PCR檢測方法可以達(dá)到預(yù)期效果，2 種肉類均可實(shí)現(xiàn)特異、高效的PCR擴(kuò)增與鑒別。

2.4 市售羊肉的PCR檢測

根據(jù)上述檢測方法，隨機(jī)抽取5 份市場流通中的羊肉進(jìn)行檢測。由圖5可知，第1批羊肉在480 bp和367 bp處出現(xiàn)2 條特異性條帶a1和a2，表明該批羊肉中摻雜有鴨肉；第2、5批羊肉只在367 bp處出現(xiàn)羊的特異性目標(biāo)條帶b和e，表明該2 批羊肉中未摻雜鴨肉；而第3、4批羊肉則只在490 bp處出現(xiàn)鴨的特異性目標(biāo)條帶c和d，說明該2 批羊肉為假冒產(chǎn)品。陰性對(duì)照樣品未出現(xiàn)條帶。

將條帶a1、a2、b、c、d、e的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中羊和鴨的線粒體Cytb基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖6～7所示。

由圖6～7可知，a2、b和e序列確實(shí)位于羊線粒體Cytb基因序列上，a1、c和d序列確實(shí)位于鴨線粒體Cytb基因序列上。

3 討 論

市場調(diào)研結(jié)果表明，流通領(lǐng)域中的羊肉有不同程度的摻偽造假現(xiàn)象，其中尤以摻雜鴨肉現(xiàn)象最為突出[15]，羊肉的質(zhì)量安全逐漸受到消費(fèi)者和市場監(jiān)管部門的重視。因此，建立一種準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的檢測方法，對(duì)于相關(guān)部門加強(qiáng)對(duì)市場的監(jiān)管十分必要。本研究采用的PCR鑒定方法較其他方法具有更高的靈敏性、特異性和便捷性，因此其在肉類品種鑒定分析上起到重要作用[16-18]。

研究表明，在物種進(jìn)化過程中，線粒體DNA的進(jìn)化速度要快于細(xì)胞核內(nèi)的DNA[19]，因此線粒體DNA具備更明顯的種間多態(tài)性和種內(nèi)多態(tài)性，能夠更精準(zhǔn)地將有較近親緣關(guān)系的物種區(qū)分開來[20-21]。另一方面，細(xì)胞中線粒體DNA的含量是核DNA的1 000 倍以上，線粒體內(nèi)DNA具有更加穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，跟細(xì)胞核內(nèi)DNA相比，線粒體DNA的提取比較簡單，并可以應(yīng)用于PCR反應(yīng)中[22]。

因此在國內(nèi)外的研究中，用于肉類來源鑒定的序列主要位于線粒體上，其中最常用的序列為12S rDNA、16S rDNA、Cytb和D-loop等[23-26]。

本研究通過對(duì)羊、鴨的線粒體Cytb進(jìn)行分析比對(duì)，根據(jù)分析結(jié)果在序列保守區(qū)設(shè)計(jì)羊、鴨通用的上游兼并引物，并分別在兩者的序列特異區(qū)設(shè)計(jì)特異性下游引物，采用一次PCR反應(yīng)的方法鑒別羊肉中是否摻雜鴨肉，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，該方法可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)體系中體現(xiàn)出2 個(gè)不同物種的特異性，且引物序列具備靈敏性和穩(wěn)定性；所建立的PCR檢測方法樣品用量少，可在幾小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確、快速地得出結(jié)果，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

隨著生物技術(shù)（基因芯片、蛋白質(zhì)芯片等）的飛速發(fā)展和其他新興技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，在后續(xù)的工作中，需要進(jìn)一步加強(qiáng)基因檢測等多種檢測技術(shù)的結(jié)合使用，擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域[27-28]。例如：基于基因的多態(tài)性，在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展指紋圖譜技術(shù)和DNA條形碼技術(shù)，不僅可以鑒定物種還可以追蹤溯源[29-30]；在生產(chǎn)及檢測過程中引入大數(shù)據(jù)技術(shù)，構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，共享物種的特征數(shù)據(jù)及模型；在現(xiàn)有的檢測技術(shù)基礎(chǔ)上，研發(fā)更加低成本、高通量、準(zhǔn)確可靠的檢測方法，提高摻假檢測鑒別的能力，完善肉類摻假檢測技術(shù)體系，為我國肉類食品的質(zhì)量安全做好保障，這些工作需要在今后的研發(fā)中作進(jìn)一步的探索。

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