李小杰，馬建強，姚明哲，陳亮

中國農業(yè)科學院茶葉研究所 國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008

茶氨酸合成酶基因的SNP挖掘和遺傳定位

李小杰，馬建強，姚明哲*，陳亮*

中國農業(yè)科學院茶葉研究所 國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008

茶氨酸合成酶（Theanine synthetase, TS）基因是茶樹茶氨酸代謝過程中的關鍵酶基因。本研究以氨基酸含量差異明顯的親本及其雜交所得F1子代為研究材料，克隆TS基因的cDNA序列，挖掘其SNPs位點，并成功將雜合SNP位點定位在遺傳連鎖群上。研究結果顯示，通過序列比對在親本間檢測到3個SNPs，驗證得到1個雜合的位點SNP735。將此位點成功轉化為dCAPS標記，該標記在子代中的基因型分離比為1∶1，利用該群體已構建的茶樹遺傳圖譜進行遺傳定位，將dCAPS標記定位在連鎖群LG03上，相鄰標記為TM299和TM517。聯(lián)合此標記及其相鄰標記與游離氨基酸總含量和茶氨酸含量進行統(tǒng)計分析，表明具有顯著的相關性。

茶樹；TS；SNP；dCAPS標記；定位；茶氨酸

游離氨基酸是影響茶葉品質的主要功能成分之一，其中茶氨酸是茶葉的標志性物質，占游離氨基酸總量的50%～70%[1-3]，具有降血壓與安神等特殊的生理功能[4]，是近年來的研究熱點。

茶氨酸合成酶（Theanine synthetase, TS）是茶樹茶氨酸合成代謝途徑中的關鍵酶之一。Yukitaka等[5]最先從茶樹嫩梢中克隆出兩條茶氨酸合成酶基因序列TS1和TS2，并通過原核表達方法證實它們具有茶氨酸合成酶的活性，其登錄號分別為DD410895和DD410896。李娟等[6]克隆了TS1的cDNA全長序列（JN226569）。在NCBI已經收錄的茶樹基因序列中，TS基因與部分谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase, GS）基因（AB115183、JQ925873）序列相似性較高，推測TS基因可能是GS基因家族成員。陳琪等[7]利用原核表達和生物信息學方法對TS1（DD410895）和GS（AB115184）進行功能驗證與結構預測分析，認為兩個基因開放閱讀框（Open read frame, ORF）序列內3個堿基的差異，造成了二者功能的不同，并初步推斷TS基因屬于GS基因家族成員。由于目前茶樹尚無參考基因組序列，TS基因的功能與其來源問題仍需要深入研究。

本研究以茶樹品種迎霜（YS）與北躍單株（BD）及其雜交所得F1代為材料，通過克隆TS基因的cDNA序列，進行SNPs挖掘與分析，將檢測到的SNP位點轉化為dCAPS標記，對F1群體進行基因型鑒定，實現(xiàn)TS基因在遺傳圖譜上的定位，并驗證了dCAPS標記與游離氨基酸總含量和茶氨酸含量變異的相關性，以期為茶樹分子標記輔助育種提供一定的理論基礎[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

以茶樹品種迎霜與北躍單株及其雜交所得F1代為試驗材料，采摘長勢一致的茶樹葉片，用液氮冷凍處理，保存在－80℃中備用[11]。

1.2 方法

1.2.1 目標基因的擴增

采用RNA提取試劑盒RNApure Plant Kit (DNase I)（康為），按說明書操作提取親本及F1代葉片的RNA。用微量紫外檢測儀ND-1000UV-Vis測定其濃度和純度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。采用cDNA合成試劑盒 PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)，將提取的RNA反轉錄成cDNA，并稀釋到200 ng·μL-1待用。

TS基因參考序列登錄號為JN226569。采用Primer Premier 5.0軟件設計PCR擴增所用的特異引物，其中TS-10引物參考李娟等[6]發(fā)表的序列，引物序列詳見表1，由上海華津生物技術公司合成。PCR擴增體系為50 μL，其中10×PCR Buffer 5 μL，dNTP（2 mmol·L-1）5 μL，MgSO4（1.5 mmol·L-1）3 μL，模板cDNA 2 μL，上、下游引物（10 mmol·L-1）各1.5 μL，KOD-Plus-Neo酶（1 U·μL-1）1 μL，加水至終體積50 μL。反應程序為：94℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，68℃ 30 s，68℃ 7 min，30個循環(huán)。PCR擴增產物采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓電泳30 min后進行鑒定[12-13]。將具有目標單一條帶的PCR產物送交上海華津生物公司測序。

1.2.2 SNPs挖掘與dCAPS標記的轉化

利用序列比對軟件Seqman比較親本及子代PCR產物測序峰圖，進行SNPs挖掘。當同一位置的測序峰圖出現(xiàn)差異，即視為SNP位點；當同一位點呈大小相近的雙峰，即視為雜合SNP位點[14-15]。對篩選出的SNP雜合位點（表2），利用dCAPS Finder 2.0（http://helix. wustl.edu/dcaps/dcaps.html）和Primer Premier 5.0軟件進行錯配引物和序列另一側引物的設計[16-17]。共設計了5對引物，詳見表3。PCR反應體系50 μL，其中10×PCR Buffer (Mg2+plus) 5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1each) 4 μL，模板cDNA 2 μL，上、下游引物（10 mmol·L-1）各1 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.25 μL，加水至終體積50 μL。PCR反應程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，61℃ 30 s，72℃30 s，72℃ 7 min，30個循環(huán)。對PCR產物進行酶切鑒定，反應體系20 μL，其中PCR產物10 μL，Buffer 2 μL，限制性內切酶Eco47 III (Takara) 1 μL，ddH2O 7 μL。酶切反應溫度37℃，反應時長5 h。酶切產物用2.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

表2 SNPs位點信息Table 2 The information of SNPs locus

表3 dCAPS標記引物信息Table 3 The information of dCAPS marker primers

1.2.3 酶切帶型分析與基因定位

為了驗證酶切結果的準確性，將F1子代酶切前的PCR產物進行測序驗證。通過序列峰圖比對，檢測每個子代的測序峰圖與酶切結果是否一致。統(tǒng)計子代基因型數(shù)據(jù)，結合該群體構建的遺傳圖譜[18]，利用JoinMap軟件將雜合SNP位點轉化的dCAPS標記定位到圖譜上。

1.2.4 dCAPS標記與氨基酸含量的相關性分析

按照《茶樹種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》中描述的方法采制茶樣[19]，采摘春季一芽二葉。用烘干機120℃熱風殺青5 min，80℃烘干至恒重，制成生化茶樣。樣品提取與測定參考GB/T 30987—2014[20]，儀器為賽卡姆全自動氨基酸分析儀（s433D）；所用試劑購自賽卡姆（北京）科學儀器有限公司。

利用MapQTL6軟件，分析dCAPS標記及其在連鎖群上的相鄰標記與茶氨酸含量及游離氨基酸總含量的相關性。

2 結果與分析

2.1 SNPs挖掘

在11對PCR特異引物中，篩選出5對引物（表1）能擴增出目標序列單一條帶。最終選擇能擴出單一條帶，且測序峰圖質量好的TS-10引物對目標基因進行擴增。PCR產物測序長度約980 bp，位于TS基因的開放閱讀框中（TS基因的開放閱讀框為1 071 bp）。對親本測序峰圖進行比對，共檢測到3個SNPs位點，其中在ORF序列第735和947位發(fā)生了轉換（C/T），第516位發(fā)生了顛換（C/G）（表2）。第735位的SNP確認為雜合位點，其中“YS”基因型為雜合（C/T），“BD”基因型為純合（CC），子代基因型表現(xiàn)為雜合（C/T）或者純合（CC）（圖1）。

圖1 SNP735雜合位點的驗證Fig. 1 Testing for the heterozygous SNP735

2.2 dCAPS標記的轉化與在F1中的分離

經過電泳鑒定，5對dCAPS引物均能獲得目標序列單一條帶。經過酶切實驗篩選，選擇條帶最清晰、最易鑒定帶型的MY1引物進行PCR擴增（圖2），相應的Eco47Ⅲ作為反應時的限制性內切酶，成功將TS基因的SNP雜合位點轉化為dCAPS標記。

對親本和148個子代的PCR產物進行酶切分析，發(fā)現(xiàn)與測序驗證結果一致。對F1子代個體基因型進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)該位點在群體中的分離比接近于1∶1，驗證了該SNP雜合位點的可靠性。

2.3 基因定位及dCAPS標記與茶氨酸的相關性

利用JoinMap軟件進行連鎖分析，結果顯示基于雜合位點SNP735轉化的dCAPS標記被定位在連鎖群LG03[18]上（圖3）。由圖3可以看出，TS基因位于3號連鎖群上約40 cm的位置，相鄰的兩個標記分別是TM299和TM517。

MapQTL6軟件檢驗結果顯示，F(xiàn)1群體茶氨酸、游離氨基酸含量變異與該dCAPS標記及其相鄰的TM299和TM517標記存在顯著相關性。但由于茶氨酸、游離氨基酸含量易受環(huán)境影響，不同年份間性狀與標記的關聯(lián)表現(xiàn)不穩(wěn)定（表4）。

圖2 F1子代PCR產物和Eco47Ⅲ酶切結果Fig. 2 The PCR products and the results of restriction endonuclease digestion byEco47Ⅲ in the F1generation

圖3 TS基因在遺傳圖譜第3號連鎖群上的定位Fig. 3 Mapping ofTSgene on LG03 linkage group

表4 Kruskal-Wallis檢驗Table 4 Kruskal-Wallis test

3 討論

本研究通過對一個F1群體進行TS基因的cDNA序列分析，開發(fā)SNPs位點，在基因的編碼區(qū)第735位核苷酸位點發(fā)掘到1個SNP雜合位點，成功地轉化為dCAPS標記。結合該群體的茶樹遺傳圖譜，將此標記定位到了第3號連鎖群上；聯(lián)合氨基酸表型數(shù)據(jù)與該標記及其在連鎖群上的相鄰標記進行統(tǒng)計分析，表明具有顯著的相關性。為茶樹分子標記輔助育種奠定了一定的理論基礎[21-22]。

茶氨酸含量是典型的數(shù)量性狀，前人研究表明茶氨酸的合成是以谷氨酸和乙胺為底物，在茶氨酸合成酶的催化下生成茶氨酸[23-24]。NCBI收錄的茶氨酸合成酶基因序列已有3條，均為cDNA序列。Deng等[25]研究了茶籽苗各部位茶氨酸合成酶基因的表達差異，結果表明TS1在新梢中表達量高于其他部位，根部相對較低；TS2在新梢和根系中表達量相同，但在子葉中的轉錄水平較低。李春芳等[26]對茶樹的13個組織部位進行轉錄組分析，共在轉錄組數(shù)據(jù)庫中注釋得到9個候選茶氨酸合成酶基因（TS），其中有3個基因在所有檢測的組織中均有表達，其余6個基因的表達模式不盡相同。這表明該酶同時受到多個基因調控，而這些基因的作用模式目前尚不清楚，是由多個基因共同作用還是某一個基因起到關鍵性作用[27-28]，這仍需要進行深入的研究。

茶氨酸合成酶基因與谷氨酰胺合成酶基因序列相似度較高，其功能與來源問題一直頗受爭議。對茶樹TS與GS基因的SNPs挖掘，實現(xiàn)在遺傳圖譜上的定位，從而確定兩個基因的位置關系，可以進一步分析TS基因的來源和與GS基因家族的關系。本研究同時也選取了與TS基因序列差異相對較多的AB115184基因序列，并對茶樹GS基因進行了SNPs挖掘，但是在該基因的編碼區(qū)并未挖掘到SNPs位點。本次對GS基因SNPs的挖掘是在一個F1群體內進行，其遺傳多樣性有一定的局限性，后續(xù)的研究可以在遺傳多樣性豐富的樣本內開展[29]，以期挖掘到更多的SNPs。

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SNP Detection and Mapping of Theanine Synthetase Gene in Tea Plant

LI Xiaojie, MA Jianqiang, YAO Mingzhe*, CHEN Liang*
Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008, China

The theanine synthetase (TS) gene is considered as the key functional gene for the synthesis of theanine in tea plant. In this study, an F1segregating population and its parents were used to detect single nucleotide polymorphism (SNP) in theTSgene for genetic mapping. According to the sequence alignment between the parents, three SNPs were found, and SNP735 was identified to be heterozygous in YS. SNP735 was subsequently transformed into dCAPS marker and used for genotyping in the F1population. The results showed that the segregation ratio of alleles at this SNP locus was close to 1∶1. The dCAPS marker was mapped to LG03 at a position between TM299 and TM517 in the tea genetic map. Meanwhile, significant correlations between the dCAPS marker and the content of theanine and total amino acid were identified in this study.

tea plant,TS, SNP, dCAPS marker, mapping, theanine

Q51；Q52

A

1000-369X(2017)03-251-07

2017-01-17

：2017-03-28

國家茶葉產業(yè)技術體系項目（CARS-023）、國家自然科學基金（31170624、31500568）

李小杰，女，碩士研究生，主要從事茶樹資源育種研究。*通訊作者